Вопросы и возможности диагностики грибковых кератитов

КОНФОКАЛЬНАЯ МИКРОСКОПИЯ

Впервые конфокальная микроскопия была описана в 1940-х гг. Г. Гольдманном [39]. Конфокальная микроскопия является методом диагностики in vivo, который позволяет исследовать передний сегмент глаза на различных уровнях и при различном масштабировании (возможно увеличение изображения в 200-500 раз) [40-42]. Неинвазивность процедуры позволяет проводить повторные исследования для контроля лечения и оценки динамики заболевания [28]. Конфокальная микроскопия может использоваться для оценки глубоких стромальных инфильтратов роговицы, для которых невозможно проведение микроскопического или культурального исследования [42].

В исследованиях P.K. Vaddavalli с соавторами (2011) показано, что чувствительность метода составляет 88,3%, а специфичность — 91,1% [43]. Конфокальная микроскопия может быть полезна при получении пациентами активной антимикотической терапии, так как в этих случаях чувствительность культурального метода значительно снижается [43].

Различные виды и роды этиологических агентов имеют особенности визуализации при проведении конфокальной микроскопии. Так, грибы родов Fusarium и Aspergillus представляются в виде высококонтрастных элементов шириной от 3 до 8 мкм и длиной 200-300 мкм [44]. Они имеют перегородки и двойной контур, постоянную форму и ширину, несимметричные ответвления. Обычно грибы-филаменты выглядят яркими линейными структурами, стенки которых параллельны друг другу [17, 43, 45]. Виды филаментов различаются между собой углом ветвления гифов: например, для грибов рода Fusarium характерен угол 90°, для рода Aspergillus — угол 45° [44]. Грибы рода Candida отличаются своими псевдогифами [46]. Они имеют вид высококонтрастных, удлиненных частиц длиной 10-40 мкм и шириной 5-10 мкм [44].

Помимо возбудителя заболевания, с помощью конфокальной микроскопии визуализируются воспалительные клетки вокруг очага инфекции, а также эпителиальная и стромальная дезорганизация, обусловленная активацией фибробластов [44].

Кроме грибковых частиц, при помощи конфокальной микроскопии можно также выявить нервные волокна роговицы и оценить их состояние. В норме они визуализируются как яркие продолговатые единообразные (нервные волокна) или бусоподобные (суббазальные сплетения) структуры толщиной от 5 до 20 мкм, имеющие ответвления, отходящие под острым углом [42]. При повреждении нервов роговицы развивается нейротрофическая кератопатия, что приводит к дополнительному повреждению роговицы и к образованию в исходе заболевания грубого рубцового помутнения, которое может значительно снижать остроту зрения пациента [47, 48]. Такие дистрофические изменения характерны для течения грибковых кератитов [48].

Стоимость оборудования, низкая доступность метода в рутинной практике, необходимость обучения персонала для верной интерпретации результатов являются значительными ограничивающими факторами для проведения исследования конфокальной микроскопии в широкой практике [42].

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

К молекулярным методам диагностики грибковых кератитов относятся полимеразная цепная реакция и масс-спектрометрия. Несомненным преимуществом данных методов является оперативность и высокая точность получения информации об инфекционном агенте.

Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является современным методом обнаружения компонентов ДНК инфекционного агента в образце ткани. ПЦР представляет собой ферментативную амплификацию участка ДНК. Для исследования достаточно даже небольшого количества ДНК этиологического агента (10 пг грибов рода Candida, 100 пг грибов-филаментов [49]), что является преимуществом для обнаружения патогенного организма, при культивировании которого возникают трудности. ПЦР-диагностика является быстрым методом диагностики, так как требует всего 2,5 часа для получения достоверного результата после извлечения ДНК из образца [50]. Материалами для проведения исследования могут служить: внутриглазная жидкость, слеза, «свежие» ткани глаза, формалин- или парафин-фиксированные ткани, окрашенные или неокрашенные цитологические срезы, из которых может быть получена ДНК [17]. Чувствительность метода ПЦР составляет 94%, специфичность — 64% [24]. Низкая специфичность обусловлена тем, что результат ПЦР может быть положительным даже в том случае, когда микроорганизм нежизнеспособен. Ложноположительные результаты составляют около 3% [2], что всегда нужно иметь в виду при оценке результата. В своем исследовании N. Menassa с соавторами показали, что у 1-8,3% пациентов без грибкового кератита методом ПЦР выявлялись ДНК различных видов грибов [51]. Тем не менее ПЦР — один из наиболее ценных методов диагностики кератомикозов, так как позволяет получить результат в короткие сроки [52, 53], а также может использоваться для обнаружения неспорообразующих грибов [54]. Из-за высокой чувствительности ПЦР диагностика не может быть использована для оценки динамики заболевания и ответа на терапию вследствие невозможности определить жизнеспособность микроорганизмов. Наконец, при ПЦР можно идентифицировать только того возбудителя, для которого существуют праймеры и имеется известная последовательность ДНК. Полимеразная цепная реакция не предоставляет информации о клеточном строении и локализации этиологического агента [55].

Из-за высокой стоимости и ограниченной доступности метода ПЦР некоторые авторы рекомендуют выполнять его не сразу же при подозрении на грибковый этиологический агент, а в течение одной недели при отрицательном результате посева материала на питательных средах [24].

Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия является методом, позволяющим быстро идентифицировать и классифицировать микроорганизмы [56]. В основе метода масс-спектрометрии лежит получение масс-спектра рибосомальных белков исследуемого микроорганизма, являющихся высоко консервативными и видоспецифичными, и сравнение его с масс-спектрами, содержащимися в базе данных. Степень сходства выражается в относительных единицах, что позволяет сделать вывод о принадлежности микроорганизма к тому или иному виду [57].

В настоящее время существует три основных подхода к определению протеома клетки: 1) «классическая» стратегия «снизу-верх» основана на разделении белковых фракций c помощью ферментного гидролиза на мелкие фрагменты белковых молекул с последующим масс-спектрометрическим анализом пептидов; 2) метод «панорамной протеомики» основан на ферментном гидролизе комплексов белковых молекул c последующим отщеплением пептидов от ферментов с помощью капиллярного хроматографа или электрофоретического сепаратора; 3) методика «сверху-вниз» заключается в масс-спектрометрическом анализе изолированных фрагментированных протеинов, полученных с помощью комплекса процедур очистки [58]. Стоит также отметить, что дрожжеподобные грибы имеют толстую стенку, поэтому для их распознавания необходим дополнительный этап разрушения клеточной стенки, аналогичный с протоколами идентификации бактериальных клеток [59].

 Для определения этиологии кератита используют слезу пораженного глаза в качестве исследуемого материала и слезу контрлатерального глаза для контроля [60]. Для подтверждения грибковой этиологии кератита исследуют не только наличие рибосомальных белков и протеинов, выделяемых клеткой гриба в процессе метаболизма (например, количество глутаредоксина и глутаредоксин-связанных протеинов), но и количественное изменение белков слезы человека. Так, для кератомикозов характерно снижение количества прекурсора цистатина S, прекурсора цистатина SN, цистатина, липокалина слезы человека, а также увеличение количества пролактин-индуцированного протеина и прекурсора сывороточного альбумина [60].

Метод масс-спектрометрии является быстрым — результат может быть получен в течение 24 часов с момента взятия материала, что позволяет быстро назначить адекватную терапию. Метод имеет высокую специфичность (97%) и высокую чувствительность — для идентификации необходимо всего 10 пг протеома этиологического агента [61]. Однако одним из основных недостатков метода является отсутствие данных белковых профилей всех возможных микроорганизмов [62]. Это может привести к отрицательному или ложному результату исследования в случае развития кератита, вызванного редкими видами грибов.

Таким образом, на основе данных литературы можно сделать заключение, что на сегодняшний день в распоряжении врачей имеется множество путей для оперативной идентификации грибковой инфекции. Тем не менее ни один из представленных методов не является эталонным, и их применение в широкой практике крайне ограничено.

Использование красителей сопряжено с необходимостью организации рабочего места для проведения исследований (особенно при проведении исследований у неотложных пациентов), наличия опыта работы с ними как у офтальмолога, так и микробиолога.

Инструментальные методы диагностики (ОКТ, конфокальная микроскопия) являются неинвазивными и могут использоваться многократно у одного пациента, однако требуют большого опыта от исследователя для верной интерпретации получаемых изображений.

Для молекулярных методов диагностики характерны высокая чувствительность при относительно невысокой специфичности вследствие возможности получения ложноположительных результатов. Однако основными ограничениями их использования на сегодня являются высокая стоимость исследования, необходимость наличия сложного оборудования и обученного персонала. Кроме того, в настоящее время не накоплена база данных ДНК- и белковых профилей всех существующих микроорганизмов, в особенности возбудителей грибковой инфекции.

При использовании единственного метода исследования можно предположить лишь наиболее вероятного возбудителя заболевания. Для наиболее точной верификации предпочтительнее использовать комбинации различных методик в сочетании с традиционными культуральными методами диагностики. Проблема диагностики грибковой инфекции глаз требует дальнейших разработок и совершенствования.

Литература

1. Vemuganti GK, Garg P, Gopinathan U et al. Evaluation of agent and host factors in progression of mycotic keratitis: A histologic and microbiologic study of 167 corneal buttons. Ophthalmology. 2002;109 (8):1538—1546.
2. Thomas PA. Fungal infections of cornea. Eye. 2003;17 (8):852-862.
3. Wilson LA., Ajello L. Agents of oculomycosis: fungal infections of the eye. London: Arnold, 1998;525-567.
4. Kredics L, Narendran V, Shobana CS, Vagvolgyi C, Manikandan P. Indo-Hungarian Fungal Keratitis Working G. Filamentous fungal infections of the cornea: a global overview of epidemiology and drug sensitivity. Mycoses 2015; 58:243-260.
5. Gopinathan U, Garg P, Fernandes M, Athmanathan S, Rao GN. The epidemiological features and laboratory results of fungal keratitis: a 10-year review at a referral eye care center in South India. Cornea. 2002;21 (6):555-559.
6. Thomas PA, Kuriakose T, Kirupashan-ker MP. Use of lactophenol cotton blue mounts of corneal scrapings as an aid to the diagnosis of mycotic keratitis. Diagn Microbiol Infect Dis. 1991;14 (3):219-224.
7. Zhang W, Yang H, Jiang L, Han L, Wang L. Use of potassium hydroxide, giemsa and calcofluor white staining techniques in the microscopic evaluation of corneal scrapings for diagnosis of fungal keratitis. Journal of International Medical Research. 2010;38 (6):1961—1967.
8. Sharma S, Silverberg M, Mehta P et al. Early diagnosis of mycotic keratitis: predictive value of potassium hydroxide preparation. Indian J Ophthalmol. 1998;46 (1):31-35.
9. Vanzzini Zago V, Alcantara Castro M, Naranjo Tackman R. Support of the laboratory in the diagnosis of fungal ocular infections. Int J Inflam. 2012;2012:643104. 8 pp.

10. Mittal R, Jena SK, Desai A, Agarwal S. Pythium Insidiosum Keratitis: Histopathology and Rapid Novel Diagnostic Staining Technique. Cornea. 2017 Sep;36 (9):1124—1132.
11. Kanungo R, Srinivasan R, Rao RS. Acridine orange staining in early diagnosis of mycotic keratitis. Acta Ophthalmol (Copenh). 1991 Dec;69 (6):750-753.
12. Joseph J, Murthy S, Garg P, Sharma S. Microscopic Evaluation of Corneal Scrapings using Different Stains for the Diagnosis of Microsporidial Keratitis. J Clin Microbiol. 2006, 22 (4): 583-585.
13. Lan L, Wang FY, Zeng G. Staining with methylthioninium chloride for the diagnosis of fungal keratitis. Exp Ther Med. 2013 Nov;6 (5):1229—1232.
14. Moemen D, Bedir T, Awad EA, Ellayeh A. Fungal keratitis: Rapid diagnosis using methylene blue stain. EJBAS. 2015;2:289-294.
15. Rosa RH, Miller D, Alfonso EC. The changing spectrum of fungal keratitis in south Florida. Ophthalmology. 1994;101 (6):1005—1013.
16. Rao NA. A laboratory approach to rapid diagnosis of ocular infections and prospects for the future. Am J Ophthalmol. 1989;107 (3):283-291.
17. Thomas PA. Current perspectives on ophthalmic mycoses. Clin Microbiol Rev. 2003; 16 (4):730-797.
18. Panda A, Sharma N, Das G, Kumar N, Satpathy G. Mycotic keratitis in children: epide-miologic and microbiologic evaluation. Cornea. 1997;16 (3):295-299.
19. Wong TY, Ng TP, Fong KS, Tan DT. Risk factors and clinical outcome between fungal and bacterial keratitis: a comparative study. CLAO J. 1997;23 (4):275-281.
20. Xie L, Dong X, Shi W. Treatment of fungal keratitis by penetrating keratoplasty. Br J Ophthalmol. 2001;85 (9):1070—1074.

21. Jacob P, Gopinathan U, Sharma S, Rao GN. Calcium alginate swabs versus Bard-Parker blade in the diagnosis of microbial keratitis. Cornea. 1995;14 (4):360-364.
22. Liesegang TJ, Forster RK. Spectrum of microbial keratitis in South Florida. Am J Ophthalmol. 1980;90 (1):38-47.
23. Ishibashi Y. Oral ketoconazole therapy for keratomycosis. Am J Ophthalmol. 1983; 95 (3):342-345.
24. Pouyeh B, Galor A, Miller D, Alfonso EC. New horizons in one of ophthalmology’s challenges: fungal keratitis. Expert Rev. Ophthalmol. 2011;6 (5):529-540.
25. Ishibashi Y, Kaufman HE. Corneal biopsy in the diagnosis of keratomycosis. Am J Ophthalmol. 1986;101 (3):288-293.
26. Kompa S, Langefeld S, Kirchkof B, Schrage N. Corneal biopsy in keratitis performed with the microtrephine. Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol. 1999;237 (11):915-919.
27. Alexandrakis G, Haimovici R, Miller D, Alfonso EC. Corneal biopsy in the management of progressive microbial keratitis. Am J Ophthalmol. 2000;129 (5):571-576.
28. Sharma S. Diagnosis of fungal keratitis: current options. Expert Opin Med Diagn. 2012;6 (5):449-455
29. Sharma S, Kunimoto DY, Gopinathan U et al. Evaluation of corneal scraping smear examination methods in the diagnosis of bacterial and fungal keratitis. Cornea. 2002;21 (7):643-647.
30. Chander J, Chakrabarti A, Sharma A, Saini JS, Panigrahi D. Examination of calcofluor staining in the diagnosis of fungal corneal ulcer. Mycoses. 1993;36 (7-8):243-245.
31. Lalitha P, Vijayakumar, Prajna NV, Srinivasan M. Aravind’s Atlas of Fungal Corneal Ulcers: Clinical Features and Laboratory Identi-fication Methods. India: Jaypee Brothers Medical Publishers, 2008:160pp.
32. Radhakrishnan A. Fungal keratitis. Kerala J Ophthalmol. 2011;23 (1):20-24.
33. Thomas PA, Kuriakose T. Rapid detection of Acanthamoeba cysts in corneal scrapings by lactophenol cotton blue staining. Arch Ophthalmol. 1990;108 (2):168.
34. Monheit JE, Cowan DF, Moore DG. Rapid detection of fungi in tissues using calcofluor white and fluorescence microscopy. Arch Pathol Lab Med. 1984;108:616.
35. Koch HH, Pimsler M. Evaluation of Uvitex 2B. A nonspecific fluorescent stain for detecting and identifying fungi and algae in tissue. Lab Med. 1987;18 (9):603-606.
36. Konstantopoulos A, Kuo J, Anderson D, Hossain P. Assessment of the use of anterior segment optical coherence tomography in microbial keratitis. Am J Ophthalmol. 2008;146 (4):534-542.
37. Hixson A, Blanc S, Sowka J. Monitoring keratitis resolution with optical coherence tomography. Optometry and Vision Science. 2014; 91:40-45.
38. Takezawa Y, Suzuki T, Shiraishi A. Observation of retrocorneal plaques in patients with infectious keratitis using anterior segment optical coherence tomography. Cornea. 2017; 36 (10):1237—1242.
39. Goldmann H. Spaltlampenphotographie und-photometrie. Ophthalmologica. 1940;98:257-270.
40. Katz NN, Wadud SA, Ayazuddin M. Corneal ulcer disease in Bangladesh. Ann Ophthalmol. 1983;15:834-836.
41. Kaufman SC, Musch DC, Belin MW. et al. Ophthalmic technology assessment committee cornea panel. Confocal microscopy: a report by the American Academy of Ophthalmology. Ophthalmology. 2004;111 (2):396-406.
42. Das S, Samant M, Vaddavalli PK, Vemuganti GK. Role of Confocal Microscopy in Deep Fungal Keratitis. Cornea. 2009;28:11-13.
43. Vaddavalli PK, Garg P, Sharma S et al. Role of confocal microscopy in the diagnosis of fungal and Acanthamoeba keratitis. Ophthalmology. 2011;118 (1):29-35.
44. Brasnu E, Bourcier T, Dupas B et al. In vivo confocal microscopy in fungal keratitis. Br J Ophthalmol. 2006;91 (5):588-591.
45. Winchester K, Mathers WD, Sutphin JE. Diagnosis of Aspergillus keratitis in vivo with confocal microscopy. Cornea. 1997;16 (1):27-31.
46. Chang HY, Chodosh J. Diagnostic and therapeutic considerations in fungal keratitis. Int Ophthalmol Clin. 2011;51 (4):33-42.
47. Nishida T. Neurotrophic mediators and corneal wound healing. The Ocular Surface. 2005; 3 (4):194-202.
48. Kurbanyan K, Hoesl LM, Schrems WA, Hamrah P. Corneal nerve alterations in acute Acanthamoeba and fungal keratitis: an in vivo confocal microscopy study. Eye. 2012;26 (1):126-132.
49. Jaeger EE, Carroll NM, Choudhury S et al. Rapid detection and identification of Candida, Aspergillus, and Fusarium species in ocular samples using nested PCR. J Clin Microbiol. 2000;38 (8):2902—2908.
50. Goldschmidt P, Degorge S, Benallaoua D. et al. New strategy for rapid diagnosis and charac-terization of keratomycosis. Ophthalmology. 2012; 119 (5):945-950.
51. Menassa N, Bosshard PP, Kaufmann C, Grimm C. Rapid detection of fungal keratitis with DNA-stabilizing FTA filter paper. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010;51 (4):1905—1910.
52. Ferrer C, Colom F, Frases S et al. Detection and identification of fungal pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S ribosomal DNA typing in ocular infections. J Clin Microbiol. 2001;39 (8):2873—2879.
53. Ferrer C, Munoz G, Alio JL, Abad JL, Colomm F. Polymerase chain reaction diagnosis in fungal keratitis caused by Alternaria alternata. Am J Ophthalmol. 2002;133 (3):398-399.
54. Badenoch PR. Pythium insidiosum keratitis confirmed by DNA sequence analysis. Br J Ophthalmol. 2001;85 (4):496.
55. Rajeev B, Biswas J. Molecular biologic techniques in ophthalmic pathology. Indian Journal of Ophthalmology. 1998;46 (1):3-13.
56. Chalupová J, Raus M, Sedlářová M, Sebe-la M. Identification of fungal microorganisms by MALDI-TOF mass spectrometry. Biotechnol Adv. 2014;32 (1):230-241.
57. Ломинадзе ГГ, Семенова ЕА, Мотузова ОВ, Калакуцкая АН. Использование метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для ускорения идентификации микроорганизмов в гемокультурах пациентов с подозрением на сепсис. Поликлиника. 2014;1 (3):17-20. [Lominadze GG, Semenova EA, Motuzova OV, Kalakuckaja AN. Using MALDI-TOF for accelerated identification of microorganisms in hemoculture of patients with suspected sepsis. Poliklinika. 2014;1(3):17-20]
58. Domon B, Aerbersold R. Mass Spectro-metry and Protein Analysis. Science. 2006; 312 (5771):212-217.
59. Rizzato C, Lombardi L, Zoppo M, Lupetti A, Tavanti A. Pushing the Limits of MALDI-TOF Mass Spectrometry: Beyond Fungal Species Identification. J Fungi. 2015;1 (3):367-383;
60. Ananthi S, Chitra T, Bini R, Prajna NV, Lalitha P. Comparative analysis of the tear protein profile in mycotic keratitis patients. Mol Vis. 2008;12 (14):500-507.
61. Leaw SN, Chang HC, Barton R, Boucha-ra JP, Chang TC. Identification of medically important Candida and non-Candida yeast species by an oligonucleotide array. J Clin Microbiol. 2007;45 (7):2220—2229.
62. Brandt ME, Lockhart SR. Recent taxonomic developments with Candida and other opportunistic yeasts. Curr Fungal Infect Rep. 2012;6 (3):170-177.

P.S. Авторы будут благодарны за возможные отклики и сотрудничество с коллегами, занимающимися вопросами диагностики грибковой инфекции.

Обрубов Анатолий Сергеевич, as.obrubov@yandex.ru

Обзор на тему «Возможности и перспективы лечения грибковых кератитов» читайте в следующем номере газеты