Часть 2. Некультуральные методы диагностики грибковых кератитов (обзор литературы)
Как мы уже отмечали в последние годы частота грибковых кератитов значительно возросла [1]. При этом более 70 видов грибов могут вызывать развитие грибковых кератитов [2-4]. Основными подходами микробиологической диагностики в настоящее время остаются культуральные методы. Однако их недостатками являются длительность исследования, высокие требования к забору материала, повышенные требования к квалификации персонала лабораторий. В реальной клинической практике у врача, сталкивающегося с тяжелой инфекцией глаз, часто нет времени для ожидания результатов и ему требуются минимально затратные по времени методы диагностики для адекватного подбора этиотропной терапии. Бурное развитие молекулярной биологии и техники значительно расширили диагностические возможности инфекций глаз. Мы решили оценить возможности современных некультуральных методов диагностики грибковой инфекции глаз, которые могут быть полезны в практике врача.
К основным некультуральным методам подтверждения диагноза грибкового кератита на сегодняшний день относятся прямая микроскопия образца, полученного с очага поражения, конфокальная микроскопия роговицы, а также современные молекулярные методы исследования. Ценным дополнительным методом диагностики может быть оптическая когерентная томография переднего отрезка глаза.
ПРЯМАЯ МИКРОСКОПИЯ
Самым быстрым методом выявления возбудителя в образце является метод прямой микроскопии с применением таких методов окраски, как окрашивание по Граму и по Гимзе, фиксация раствором гидроксида калия, окрашивание лактофенолом хлопковым голубым, калькофлуором белым, метенамином-серебра по Гомори, а также комбинированные методы окраски (комбинированное окрашивание по Гимзе с калькофлуором белым, фиксация гидроксидом калия в сочетании с окраской калькофлуором белым) [5-8]. Полезными могут быть также методы окрашивания Шифф-йодной кислотой [9, 10] и акридиновым оранжевым [11], модифицированный метод окраски по Цилю-Нильсену [12] и другие [10, 13, 14].
При микроскопии образца оцениваются вид мицелия, конидии (для грибов-конидиеносцев), гифы и их взаиморасположение с оплодотворяющими органами грибов. Существует ряд трудностей, с которыми можно столкнуться при идентификации этиологического агента с помощью прямой микроскопии образца. Основными сложностями данного метода являются неверная интерпретация результатов, наличие артефактов, редкое выявление грибов рода Candida и других дрожжеподобных грибов [15-17]. Также метод прямой микроскопии требует обязательного предварительного окрашивания. Если в образец не были добавлены специальный контраст или красящий агент, то грибы будут визуализироваться как бесцветные структуры на окрашенном фоне и их идентификация будет затруднена [17-20].
Основными материалами, служащими источником для прямой микроскопии, являются:
– стерильный материал на ватном тампоне или мазок, собранный посредством оттиска кальциевой альгинатной массой, с конъюнктивы и век обоих глаз [21];
– соскоб с роговицы, собранный с помощью шпателя Kimura, лезвием Bard-Parker, стерильным бритвенным лезвием, хирургическими лезвием или шпателем. Манипуляции проводятся под местной анестезией [21-23]. Материал для микроскопии собирают с основания и краев язвы;
– контактные линзы, контейнеры для линз и многофункциональный раствор для линз [24];
– материал роговицы, полученный при выполнении сквозной или послойной кератопластики [1, 15];
– биоптат роговицы [25-27].
Биопсия роговицы может быть эффективнее соскобов при глубоком расположении инфильтрата в строме роговицы и отсутствии обширного эпителиального дефекта [25-27].
Чувствительность и специфичность метода прямой микроскопии достигает 90% [28, 29].
Рассмотрим подробнее основные методы окрашивания для исследования методом прямой микроскопии.
Фиксация раствором гидроксида калия
По данным разных авторов, чувствительность метода составляет 71% [30], 81% [8, 15], 90-91% [5, 18]. Специфичность микроскопии с фиксацией гидроксидом калия — 83,8% [8]. Данный метод является экономичным, требующим всего 1-2 этапа подготовки. К преимуществу использования гидроксида калия относится прокрашивание даже толстых образцов роговицы, что обеспечивает контрастность грибковой структуры относительно фона [17]. Метод фиксации раствором гидроксида калия с последующей микроскопией позволяет получить результат уже через 10-15 минут от момента взятия образца материала [16].
К недостаткам метода относятся достаточно большая частота выявления артефактов [30]. Клетки толстого образца роговицы могут быть недостаточно прозрачными для точной микроскопии. Окрашивающийся гидроксидом калия препарат имеет короткий срок годности. Оптимальным временем для исследования является период в пределах 12-18 часов с момента взятия образца [17].
Грибы-филаменты визуализируются как отражающие свет гифы, с перегородками или без них. Гифы могут быть одинарными или разветвленными. Для феоидных грибов характерен коричневый цвет филаментов, появляющийся вследствие накопления меланина в клеточной стенке. Дрожжи и дрожжеподобные грибы имеют овальную или круглую форму, часто обесцвечены. Возможно образование псевдогифов, которые необходимо дифференцировать с клетками эпителия [31].
Метод окраски по Граму
По данным различных авторов, чувствительность метода окраски по Граму колеблется от 36 до 73% [2, 6, 22, 29]. Специфичность метода составляет 84,9% [29]. Окрашивание по Граму позволяет хорошо визуализировать как клетки дрожжеподобных грибов, так и гифы грибов-филаментов. В случае микст-инфекции бактерии также могут быть идентифицированы в материале. Для получения результата требуется от 15 до 30 минут [16].
К недостаткам метода относится неравномерная окраска цитоплазмы гифов грибов. Метод неэффективен при окрашивании толстых образцов взятого материала. Возможно наличие ложноположительных результатов вследствие возникновения артефактов. Кроме того, преципитаты краски могут привести к неправильной интерпретации результатов [17].
Грибы-филаменты подразделяются на грам-положительные и грам-отрицательные. Грам-положительные нитчатые грибы представляются фиолетовыми (синими), грам-отрицательные — розовыми. Все дрожжеподобные грибы являются грам-положительными, имеют овальную или округлую форму [31].
Метод окраски по Гимзе
Чувствительность метода оценивается от 39,7% [15] до 66% [32].
При окрашивании по Гимзе приобретает цвет только цитоплазма клетки, клеточная стенка остается интактной. Споры выглядят более мелкими, чем при окрашивании другими методами.
Окрашивание лактофенолом хлопковым голубым
Чувствительность метода составляет 77-82% [6, 8]. Окрашивание лактофенолом хлопковым голубым является быстрым (приготовление препарата занимает 5 минут [6]), простым, недорогим, одноступенчатым методом окраски, который позволяет выявить все основные виды грибов [17]. Окрашивание лактофенолом позволяет также обнаружить наличие цист Acanthamoeba [33]. Метод коммерчески выгоден: краситель имеет длительный срок хранения и может храниться годами [17].
Однако лактофенол хлопковый голубой плохо проникает в ткани, что приводит к затруднению в использовании на толстых образцах взятого материала. Контраст между прокрашенным грибом и фоном может быть недостаточным для идентификации, поэтому нетипичные виды грибов могут быть упущены [6, 17].
Гифы и конидии визуализируются черными или темно-коричневыми на голубом фоне [31].
Окрашивание красителем метенамин-серебро по Гомори
Чувствительность метода составляет 85-86% [16, 22]. Клеточные стенки грибов и перегородки ярко очерчены и хорошо видны на бледном фоне, что повышает вероятность идентификации вида гриба. Элементы гриба окрашиваются от серебристого до черного цвета и хорошо видимы в слое образца ткани [31]. Помимо грибов, также могут идентифицироваться цисты Acanthamoeba и Pneumocystis carinii [17].
Недостатком такого метода является избыточное депонирование серебра в тканях, что может скрывать детали морфологии гриба. Прокрашивание клеточных включений и меланина может давать ложноположительные результаты и неправильную интерпретацию. Реагенты и процедура окрашивания не стандартизированы [17]. Процедура является многоступенчатой, требуя 2-3 часов для подготовки образца для изучения [16].
Окрашивание калькофлуором белым
Чувствительность метода составляет 80-90% [5]. Гифы грибов и клетки дрожжей визуализируются хорошо очерченными ярко-зелеными элементами на красно-коричневом фоне [31]. Несомненным преимуществом метода является возможность даже в толстых образцах взятого материала ясно различать детали морфологии грибов. Также могут визуализироваться цисты Acanthamoeba и Pneumocystis carinii [16, 34]. Метод окрашивания является двухэтапным. Время подготовки образца для микроскопии составляет 30 минут [16].
Одним из основных недостатков данного метода окраски является обязательное приготовление свежих реагентов перед каждым окрашиванием, в противном случае высока вероятность появления артефактов [35]. Кроме того, требуется наличие сложного оборудования — для визуализации необходимо использование ультрафиолетового микроскопа [16, 17]. Во время проведения микроскопии исследователь должен быть защищен от вредного воздействия ультрафиолета. Как реагенты, так и процедура требуют стандартизации [17].
ОПТИЧЕСКАЯ КОГЕРЕНТНАЯ ТОМОГРАФИЯ
Оптическая когерентная томография (ОКТ) является современным методом визуализации переднего отрезка глаза. С помощью ОКТ можно проанализировать морфологию нормальной и пораженной инфекцией роговицы. Метод является неинвазивным, что позволяет использовать его не только для постановки диагноза, но и для наблюдения за состоянием роговицы в динамике [36].
Стромальные инфильтраты на ОКТ визуализируются гиперрефлексивными зонами в строме. Отек проявляется в виде диффузного утолщения стромы роговицы [37]. Метод ОКТ позволяет осуществлять контроль за толщиной роговицы в случае ее изъязвления или развития стромального отека. В случае экссудации в передней камере глаза воспалительные клетки выявляются в виде гиперрефлексивных плавающих точек или агрегатов на заднем эпителии роговицы, визуализирующихся при биомикроскопии как преципитаты [36]. В исследовании Takezawa Y. с соавторами (2017) было показано, что у большинства пациентов с грибковым кератитом наблюдается шероховатая линия раздела между задним эпителием и наложениями на нем, тогда как для бактериальных кератитов характерна четкая граница раздела эндотелий-преципитаты, что может служить дополнительным маркером при определении этиологии заболевания [38].
