Вопросы и возможности диагностики грибковых кератитов

А.С. Обрубов^1,2, К.И. Бельская^1,2
1ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ Филиал № 1 «Офтальмологическая клиника», г. Москва;
²Кафедра офтальмологии ФГБОУ ДПО «Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования» Минздрава России, г. Москва.

Вступление

Первый случай грибкового кератита был описан T. Leber´ом в 1879 году. С тех пор количество публикаций случаев грибковых кератитов увеличивалось с каждым годом. Значительный рост случаев грибковых кератитов отмечается в последние десятилетия, что мы видим и на примере нашей больницы.

В последние годы частота грибковых кератитов значительно возросла. На сегодняшний день описаны более 105 видов грибов, способных стать причиной развития офтальмомикозов, в том числе более 70 видов могут вызывать развитие грибковых кератитов.

Мы постарались осветить как наиболее распространенные и проверенные временем методы диагностики грибковой инфекции глаза, так и современные молекулярные и инструментальные методы, которые все больше входят в рутинную практику офтальмологов.

Познакомиться с нашими публикациями по данной теме можно также:

1. Бельская К.И., Обрубов А.С. Некультуральные методы диагностики грибковых кератитов (обзор литературы) // РМЖ «Клиническая офтальмология». – 2018. – Т. 18. – №1. – С. 37-41. DOI: 10.21689/2311—7729-2018-18-1-37-41.

2. Бельская К.И., Обрубов А.С. Культуральный метод диагностики грибковых кератитов (Обзор литературы) // XVII Всероссийская школа офтальмолога: Сб. науч. тр. – Москва, 23-24 марта 2018 г. / Под ред. проф. Е.А. Егорова. – М.: ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, 2018. – С. 99-105. DOI: 10.30808/978-5-6040782-2018-1-1-99-105.

Часть 1. Культуральный метод диагностики грибковых кератитов (обзор литературы)

Культуральная диагностика инфекций глаз остается «золотым стандартом» в микробиологических исследованиях в офтальмологии.

Культуральный метод исследования заключается в посеве исследуемого материала на искусственные питательные среды, культуры клеток или куриные эмбрионы с целью выделения и идентификации чистой культуры возбудителя или возбудителей. В микологии культуральный метод получил название микрологического.

В клинической микологии выделяют 2 основные группы грибов — плесневые (гифальные) и дрожжевые. Гифальные грибы способны образовывать тонкие, ветвящиеся гифы. Среди гифальных грибов выделяют пигментированные и непигментированные гифомицеты. Гифы, растущие над поверхностью субстрата, называются воздушными. Благодаря воздушным гифам колонии мицелия имеют пушистый вид. Дрожжевые грибы являются одноклеточными, однако структурная взаимосвязь между клетками сохраняется — возможно образование псевдомицелия. Развитие псевдомицелия наблюдается в некоторых условиях у представителей патогенного рода Candida.

Колонии дрожжеподобных грибов имеют компактный вид.

Многие грибы обладают диморфизмом — способностью к гифальному или дрожжеподобному в зависимости от условий культивирования. В инфицированном организме они растут в виде дрожжеподобных клеток (дрожжевая фаза), на питательных средах образуют гифы и мицелий. Диморфизм в том числе связан с температурным фактором: при комнатной температуре образуется мицелий, при 37°С — дрожжеподобные клетки [1].

Диморфные грибы могут существовать в тканевой и культуральной формах. Выделяют три вида диморфизма:

1) диморфизм, который сопровождается разнообразием тканевых форм и постоянством культуральных (подкласс Кокцидии, полифилетическая группа Простейшие);

2) диморфизм, который сопровождается разнообразием культуральной фазы (большая часть диморфных грибов);

3) грибы с совпадающей культуральной и тканевой формами (плесневые грибы, Candida, Cryptococcus).

Описаны более 105 видов грибов, классифицированные в 56 родов, которые вызывают грибковые заболевания глаз [2]. Наиболее часто среди нитчатых грибов, вызывающих грибковые кератиты, встречаются представители родов Fusarium, Aspergillus (светлоокрашенные, или непигментированные, или гиалогифомицеты) и представители рода Curvularia (темноокрашенные, или пигментированные, или феогифомицеты). Наиболее частым видом дрожжеподобных грибов, вызывающих грибковые кератиты, является Candida albicans (схема 1) [3].

Схема 1.

• Гифальные грибы
  • Гиалогифомицеты
    • Fusarium (F. solani, F.oxysporum)
    • Aspergillus (A. fumigatus, A.flavus)
    • Scedosporium (S. apiospermum)
    • Penicillum (P. spinulosum, P. citrinum)
    • Acremonium (A. potronii, A.kiliense)
  • Феогифомицеты
    • Curvularia (C. lunata, C. geniculata, C. senegalensis)
    • Bipolaris (B. spicifera, B.hawaiiensis)
    • Exserohilum (E. rosrtatum, E.longirostrata)
    • Coelomycetes (Lasiodiplodia, Colletotrichum)
• Дрожжи и дрожжеподобные грибы
  • Candida (C. albicans)

Материал для исследования пораженной грибковой инфекцией роговицы с помощью культурального метода получают с помощью взятия соскоба роговицы стерильными инструментами — шпатель Kimura, лезвие Bard-Parker, стерильное бритвенное лезвие, хирургическиие лезвие или шпатель. Манипуляции проводятся под местной анестезией [4-6]. Материал для микроскопии собирают с основания и краев язвы. В некоторых случаях получить соскоб с поверхности очага невозможно ввиду малого размера эпителиального дефекта или его отсутствия. В таком случае материал может быть собран при проведении биопсии роговицы [7-9] или сквозной кератопластики [10, 11]. Образец ткани роговицы транспортируют в стерильной пробирке, заполненной 1 мл дистиллированной воды.

Не рекомендуется использовать высушенные образцы роговиц [12].

Материал, собранный с роговицы, засевают на твердые (кровяной агар, агар с сердечно-мозговой вытяжкой, цистин-триптонный агар, глюкозо-пептонная агаровая среда Сабуро [3]) или жидкие питательные среды (бульон Сабуро, бульон с сердечно-мозговой вытяжкой, тиогликолевый бульон). Материал засевают штрихами в форме буквы «С» [3].

Грибы растут на большинстве сред, используемых для культивирования бактерий. Однако рост грибов медленней, чем рост бактерий, в связи с чем рекомендуют обогащенные среды, такие как агар с сердечно-мозговой вытяжкой, агар Сабуро с декстрозой, картофельно-глюкозный агар и другие [13].

Среды можно сделать более селективными для грибов, если добавить антибиотики (гентамицин, хлорамфеникол) [3]. Обычно используют минимум две среды — селективную и неселективную.

Если образец взят с обсемененной поверхности, важно использовать среду, содержащую ингибирующие агенты, такие как хлорамфеникол, гентамицин или циклогексимид. Хлорамфеникол или гентамицин ингибируют рост большинства бактерий, в то время как циклогексимид — плесневые грибы-сапрофиты. Необходимо учитывать, что циклогексимид также может ингибировать рост грибов-оппортунистов: некоторые виды родов Aspergillus, Fusarium, Scopulariopsis, Pseudallescheria, Zygomycetes, некоторые другие гифальные и дрожжевые грибы (Сryptococcus neoformans и некоторые виды рода Candida) [13].

Антибактериальные агенты также могут ингибировать рост аэробных актиномицетов, например, Nocardia [14]. Образцы со стерильных участков могут быть культивированы без ингибирующих агентов [14].

Для большинства гифальных грибов оптимальная температура культивирования среды с засевом находится в диапазоне от 25 до 30°С, в то же время большинство видов дрожжеподобных грибов показывают наилучший рост при температуре от 35 до 37°С. Образец должен быть инкубирован минимум в течение 2 недель, для подтверждения негативного результата необходимо культивирование в течение 4 недель [15-17].

Критерии для достоверного определения роста культуры, взятой с роговичного соскоба, следующие [3, 18]:

1) сплошной рост (сплошной слой культуры в месте посева на твердой питательной среде) — более 10 колоний;

2) выявление микроорганизма в клиническом образце с помощью микроскопии;

3) рост одного и того же штамма на разных питательных средах;

4) рост того же микроорганизма при повторном взятии клинического образца;

5) растущий штамм коррелирует с клинической картиной заболевания;

6) наблюдается заполнение чашки клетками на половину на стороне посева на среду при использовании одной твердой среды;

7) рост на жидкой среде подтвержден микроскопией.

Желательно проводить повторный соскоб и засев на питательные среды [3].

Ниже приведем примеры макро- и микроскопических особенностей культур различных видов грибов, высеиваемых на питательных средах (по [13]):

Дрожжеподобные грибы наиболее часто образуют круглую, тестообразную или слизеобразную колонию. Плесневые грибки образуют бархатистые или пушистые колонии голубо-зеленого, желто-зеленого или черного цвета.

Виды рода Candida образуют круглую, тестообразную или слизеобразную непрозрачную колонию белого или кремового цвета. При микроскопическом исследовании обнаруживают бластоконидии, псевдогифы, в некоторых видах встречаются хламидоспоры.

Колонии рода Aspergillus бархатистые или пушистые голубо-зеленого, желто-зеленого или черного цвета. При микроскопии идентифицируют стекловидные и разделенные перегородками гифы. Однако микроскопическая картина имеет свои особенности в зависимости от вида.

Колонии Histoplasma capsulatum представляют собой медленно растущие колонии, белые или желто-коричневые при температуре культивирования 25°С или дрожжеподобные мягкие и тестообразные белые колонии при температуре культивирования 37°С. При микроскопическом исследовании колонии, культивированной при температуре 25°С, выявляют наличие тонких перегородчатых гифов, которые продуцируют бугорчатые макроконидии. При микроскопии колоний, культивированных при температуре 37°С, выявляют мелкие овальные дрожжеподобные клетки.

Вид колоний Blastomyces derma-titis варьирует от мембранозных дрожжеподобных колоний до хлопковидных пушистых белых плесневидных колоний при температуре культивирования 25°С. При 37°С колонии имеют вид неопушенных складчатых колоний. При микроскопии колонии, культивированной при температуре 25°С, обнаруживают стекловидные перегородчатые гифы с одноклеточной мягкой конидией, при температуре 37°С — большие толстостенные гифы.

В процессе культивирования колонии Coccidioides immittis/complex сначала выглядят влажными и неопушенными, затем быстро становятся пушистыми, серо-белыми снаружи и желтоватыми или коричневыми с обратной стороны чашки. При микроскопии определяют гиалиновые гифы с артросонидиями, отходящими под прямым углом, разделенные пустыми клетками.

Колонии рода Fusarium розовые, лавандовые или пурпурные, изредка желтые. Микроскопическая картина представлена макро- и микроспоридиями, многоклеточными макроконидиями серповидной формы.

Колонии Paecilomyces разрастаются по всей поверхности чашки, бывают белого или коричневатого цветов. При микроскопии обнаруживают простые или вертикально разветвленные конидиоспоры, которые несут на себе веретена конидиогенных клеток.

Колонии феогифомицетов (Alter-naria, Curvularia, Cladosporium) отличаются быстрым ростом, на вид пушистые, серого, оливкового, черного или коричневого цветов. Микроскопическая картина представлена пигментированными гифами. Конидии могут быть единичными или в цепочке, гладкими или шероховатыми.

Scedosporium имеет пушистые серые колонии. При микроскопии определяют одноклеточные конидии.

Penicillium представляет собой быстрорастущие колонии, припудренные, широко растущие, зеленого, серого, желтого или белого цветов, изредка красноватые. Микроскопическая картина: конидио-форы обычно прямые, стекловидные или слабо пигментированные.

Таким образом, микологический метод заключается в посеве патологического материала на специальные питательные среды с целью идентификации культуры возбудителя или возбудителей.

В связи с особенностями морфологического строения различных видов грибов возможна идентификация возбудителя по макроскопической картине колонии. Основной особенностью культурального метода исследования является его продолжительность — идентификация микроорганизма возможна лишь спустя недели. Для более точной диагностики грибковых кератитов предпочтительнее использовать сочетание различных методик.

Литература

1. Мысякина И.С., Фунтикова Н.С. Роль стеринов в морфогенетических процессах и диморфизме грибов // Микробиология. – 2007. – Т. 76. – № 1. – C. 5-18.
2. Wilson L.A., Ajello L. Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. – 9th ed. – London: Arnold, 1998. – Vol. 4: Medical Mycology. – 525-567.
3. Thomas P.A. Fungal infections of cornea // Eye. – 2003. – Vol. 17. – P. 852-862.
4. Jacob P., Gopinathan U., Sharma S., Rao G.N. Calcium alginate swabs versus Bard-Parker blade in the diagnosis of microbial keratitis // Cornea. – 1995. – Vol. 14. – N 4. – P. 360-364.
5. Liesegang T.J., Forster R.K. Spectrum of microbial keratitis in South Florida // Am. J. Ophthalmol. – 1980. – Vol. 90. – N 1. – P. 38-47.
6. Ishibashi Y. Oral ketoconazole therapy for keratomycosis // Am. J. Ophthalmol. – 1983. – Vol. 95. – N 3. – P. 342-345.
7. Ishibashi Y., Kaufman H.E. Corneal biopsy in the diagnosis of keratomycosis // Am. J. Ophthalmol. – 1986. – Vol. 101. – N 3. – P. 288-293.
8. Kompa S., Langefeld S., Kirchkof B., Schrage N. Corneal biopsy in keratitis performed with the microtrephine // Graefe’s Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. – 1999. – Vol. 237. – N 11. – P. 915-919.
9. Alexandrakis G., Haimovici R., Miller D., Alfonso E.C. Corneal biopsy in the management of progressive microbial keratitis // Am. J. Ophthalmol. – 2000. – Vol. 129. – N 5. – P. 571-576.
10. Vemuganti G.K., Garg P., Gopinathan U. et al. Evaluation of agent and host factors in progression of mycotic keratitis: A histologic and microbiologic study of 167 corneal buttons // Ophthalmology. – 2002. – Vol. 109. – N 8. – 1538—1546.
11. Rosa R.H., Miller D., Alfonso E.C. The changing spectrum of fungal keratitis in south Florida // Ophthalmology. – 1994. – Vol. 101. – N 6. – P. 1005—1013.
12. Kalkanci A., Ozdek S. Ocular fungal infections // Current Eye Research. – 2010. – Vol. 36. – N 3. – P. 179-189.
13. Kalkanci A., Ozdek S., Ozmen M.C. Ocular fungal infections. – 1st ed. – Ankara: Lambert, 2015. – 92 pp.
14. Lalitha P., Vijayakumar, Venkatesh P., Srinivasan M. Aravind’s atlas of fungal corneal ulcers. – New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers, 2008. –148 pp.
15. Murray P.R., Rosenthal K.S., Pfaller M.A. Medical Microbiology. – 6th ed. – Philadelphia, PA: Mosby, Elsevier, 2009. – P. 689-699.
16. Winn Jr.W., Allen S., Janda W. et al. Koneman’s Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology. – 6th ed. – Baltimore, MD: Lippincott Williams&Wilkins, 2006. – P. 1166—1237.
17. Forbes B.A., Sahm D.F., Weissfeld A.S. Bailey&Scott’s Diagnostic Microbiology. – 12th ed. – St. Louis, Missouri: Mosby, Elsevier, 2007. – P. 629-716.
18. Sharma S., Sreedharan A. Diagnostic Procedures in Ophthalmology. – 2nd ed. – New Delhi: Jaypee Brothers Medical Publishers, 2009. – P. 316-332.