5 апреля 2018 года в ФГБНУ «НИИГБ» состоялась научно-практическая конференция с международным участием «Сканирующая электронная микроскопия в медицине, биологии, микробиологии».
Организатор: Лаборатория фундаментальных исследований в офтальмологии ФГБНУ «НИИГБ». Модератор: Андрей Бурцев.
С первым докладом на тему «Фундаментальные проблемы информативности сканирующей электронной микроскопии» выступил И.А. Новиков (ФГБНУ «НИИГБ», Москва). По мнению ряда специалистов, занимающихся проблемами электронной микроскопии, популярность этого вида исследований в медико-биологическом направлении падает. Однако «классическую» сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) нечем заменить при описании всего «твердого» из мира биологии: кости и петрификаты, насекомые с хитиновыми покровами, минеральные скелеты простейших и т.д.; имплантируемых объектов, инородных тел; сложных структурных ансамблей в тканях с «трехмерным» расположением микро- и макрообъектов. В фундаментальной медицине и биологии наиболее часто наблюдаемым объектом является клетка, в прикладной медицине — изолированный блок ткани. «Классическая» СЭМ и рутинное описание морфологии клетки предполагает сложную пробоподготовку, включающую использование вредных веществ; артефакты; «нулевую информативность»; все, что можно описать, давно описано. Развитие СЭМ предполагает высокотехнологичный путь или технологии аппаратного обеспечения (внутрикамерная обработка, обеспечение корреляционных исследований; «биохимические» (иммунные метки); низкотехнологичные, предусматривающие повышение информативности, упрощение подготовки.
Dr. Irene Wacker (Гейдельбергский университет, Германия) выступила с докладом «Rethinking Ultrastruc-tural Pathology — 3D reconstructions based on SEM imaging». Prof. Rasmus Schröder (Клиника Гейдельбергского университета, Германия) представил сообщение на тему «3D informa-tion across scales — from molecular function to large volumes». Докладчики рассказали о возможностях 3D-реконструкции.
С докладом «Комплексное применение электронной, светооптической и конфокальной мультифотонной микроскопии в исследовании биологических тканей» от группы авторов выступил профессор Н.П. Омельяненко (ФГБУ «НМИЦТиО им. Н.Н. Приорова», Москва). Комплексный характер исследования связан, прежде всего, с необходимостью объяснения результатов, полученных с применением одних методов, с помощью других методов. Микроскопия подразделяется на: световую (СМ) (стерео, прямая, инвертированная); лазерную микроскопию (ЛМ) (лазерная микроскопия, конфокальная сканирующая однофотонная, конфокальная сканирующая); сканирующую гелий-ионную микроскопию; электронную микроскопию (ЭМ) (сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), трансмиссионную электронную микроскопию (ТЭМ), сканирующую трансмиссионную электронную микроскопию (СТЭМ)); атомно-силовую микроскопию. В настоящее время все более широкое применение приобретает мультифотонная конфокальная микроскопия, позволяющая видеть «вживую» живую ткань. Технология позволяет проникать в глубину ткани на 200-300 мкм и визуализировать в реальном времени in vivo структуры с субклеточным разрешением (1 мкм). Метод применяется для работы с живыми тканями (ЖТ) — ЖТ в составе организма, ЖТ, выделенные из состава организма (тканевые фрагменты), с неживыми тканями (НЖТ) — НЖТ фиксированные, НЖТ фиксированные обезвоженные контрастированные, НЖТ обезвоженные фиксированные напыленные. Далее автор представил подробное сравнение мультифотонной конфокальной микроскопии с электронной микроскопией.
А.М. Суббот (ФГБНУ «НИИГБ», Москва) представила сообщение «Изучение животной клетки посредством СЭМ с применением метода лантаноидного контрастирования». Метод дает возможность увидеть подповерхностный слой. Протокол метода включает промывку (1-2 мин.), экспозицию с первым контрастирующим веществом (15 мин.), промывку (1 мин.), экспозицию со вторым контрастирующим веществом (10 мин.), промывку (˂1 мин.), удаление излишков влаги «воздушной кистью» (1 мин.). Области применения метода: статус клеточных культур; биоконструкции; биоптаты; эксплантированные объекты; импрессионная цитология.
Тему лантаноидного контрастирования продолжил д.м.н. И.В. Чеботарь (ФГАУ «НМИЦ здоровья детей», Москва), он рассказал о методе лантаноидного контрастирования в микробиологии. Цель исследования заключалась в демонстрации достоинств лантаноидного контрастирования в качестве ускоренной пробоподготовки микробиологических препаратов для СЭМ и обосновании возможности применения технологии в практической микробиологии. Результаты работы позволили авторам прийти к выводу о том, что предлагаемый метод пробоподготовки препаратов для СЭМ, основанный на контрастировании микробных клеток лантаноидами, обеспечивает возможность визуализировать и оценить основные морфологические структуры микробных клеток, включая форму, размеры, взаиморасположение, капсулу, некоторые внутриклеточные структуры; метод позволяет по-новому визуализировать внеклеточный матрикс биопленок; метод является быстрореализуемым, что открывает возможности практического применения в диагностических технологиях клинической микробиологии.
Л.Г. Торчинский (ООО «ОПТЭК», Zeiss Group, Москва) выступил с докладом на тему «Современная электронная микроскопия: решения и практика применения». Автор привел примеры применения современной электронной микроскопии в биологических, биомедицинских исследованиях. Первое документально зафиксированное электронно-микроскопическое изображение живой клетки было получено в 1945 году. В 1949 году появился один из первых серийных электронных микроскопов AEG-ZEISS EM 8. В 1993 году — первый Gemini SEM с комбинированной магнитно-электростатической объективной линзой, обладающей свойством минимизировать воздействие магнитного поля на образец. Прибор имел высокоэффективный in-lens SE детектор с режимом ускорения пучка. В 2001 году — появление линейки Gemini SEM LEO 1525 – LEO 1560 с режимом переменного давления (VP), широко применявшейся в биомедицинской области. В 2005—2007 годах — приборы Supra – Ultra – ULTRAPlus, обладающие возможностью параллельного in-lens SE и in-lens BSE детектирования с селекцией по энергиям; локальный компенсатор заряда позволяет исследовать непроводящие образцы с внутрилинзовой детекцией.
Основные фокус-группы сканирующих и просвечивающих электронных микроскопов: зоология, ботаника; биоматериалы; гистология и патология; микробиология.
Автор привел пример применения электронных микроскопов в определении патологии растений: этапы инфицирования плесени в близком к нативному состоянии; естественная визуализация во влажном состоянии с высоким пространственным разрешением для выявления ранних инфекционных эффектов; специальный SE для режима естественной среды позволяет получать изображение с высоким разрешением без эффекта зарядки поверхности.
Еще одной областью применения электронной микроскопии является корреляционная микроскопия. Корреляционная микроскопия Zeiss позволяет быстро найти область интереса; изучить область интереса с высоким разрешением; совместить области интереса флуоресцентного изображения с электронным.
С докладом «FIB-SEM tomography of the interface between tissue/single cells and micro electrodes» выступил Dr. Claus J. Burkhardt (Тюбингенский университет, Германия).
П.А. Сомов (ООО «Тескан», Санкт-Петербург) подробно остановился на вопросе изучения биораспределения частиц пористого кремния при внутривенном введении лабораторным крысам. Цель исследования заключалась в изучении процесса адресной доставки лекарств в заданную ткань или клетку при помощи матриц-носителей, роль которых исполняли частицы пористого кремния. Результаты проведенных исследований позволили авторам сделать вывод о том, что сканирующий электронный микроскоп позволяет находить в тканях органов частицы, состав которых отличается от биоматериала, и определять элементный состав этих частиц. Детектор отраженных электронов (BSE) позволяет легко найти области локализации включений, отличающихся по плотности, для дальнейшего детектирования элементов в этих включениях возможно использование энергодисперсионного спектрометра (EDS). Важным является этап пробоподготовки биологических образцов. Необходимо обеспечить отток заряда с образца, а также минимизировать рельеф поверхности образца. В исследуемых образцах были обнаружены частицы разных составов, содержащие ожидаемый кремний, так и другие элементы, например, кальций. Присутствие на EDS спектрах Na и Cl можно связать с использованием физиологического раствора в эксперименте. На большинстве EDS спектров, снятых в областях, не содержащих частиц, в том числе и на спектрах, снятых с образцов без введения пористого кремния, можно наблюдать незначительный пик характеристического рентгеновского излучения, соответствующий кремнию.
Страницы: 1 2
