Тема трехмерной реконструкции в электронной микроскопии была подробно освещена в докладе Д.Н. Плешкова (ООО «Техноинфо», Москва). На сегодняшний день для 3D-реконструкции существуют следующие техники: Single Particle Analysis; ТЕМ-томография и ультратонкие срезы; послойное травление в двухлучевой системе; метод Serial Block Face Imaging (SBFI). Преимущества SBFI: возможность работы с большим объемом; минимизация механических артефактов; высокая скорость получения данных; простота работы. Техника SFBI позволяет проводить 3D-реконструкцию объема до 1 куб. мм. Существующие трудности: разрешение по Z ограничено; громоздкая конструкция ультрамикротома; сложно автоматизировать процесс съемки; необходимо специализированное программное обеспечение.
Компанией ThermoFisher разработан прибор VolumeScope, совмещающий все этапы работы, от подготовки образца до визуализации 3D-реконструкции, и позволяющий решить трудности, связанные с использованием техники SFBI.
Об опыте применения лантаноидного контрастирования для визуализации бактериальной обсемененности эксплантированных из слезного канала дренажей доложил В.Д. Ярцев (ФГБНУ «НИИГБ», Москва). Факторами, влияющими на микробную контаминацию, являются: неспецифические факторы слезы (лизоцим); связанная со слизистой оболочкой лимфоидная ткань носослезного протока (MALT); непосредственный контакт с атмосферой. Вследствие хронического воспаления у пациентов развивается сужение слезных путей, вызывающее слезотечение, в отношении этих пациентов применяются различные хирургические тактики, в частности, операция по реканализации слезных путей.
В слезные пути вводится силиконовый имплантат (трубка), который через несколько месяцев удаляется. Этот лакримальный стент стал объектом исследования.
В исследовании были использованы 29 эксплантированных стентов: 10 — изучены без контрастирования, 19 — после контрастирования препаратом BioREE. Анализ полученных результатов показал, что у пациентов, у которых эксплантированные стенты были стерильны или был отмечен рост грибов, наблюдался умеренный или отрицательный клинический эффект; у пациентов, у которых наблюдался рост типичных палочек, клинический результат был положительным. Клиническая польза заключается в быстрой оценке степени обсемененности эксплантированного стента; в перспективе — возможность определения вида микроорганизма по морфологическим характеристикам.
«Характеристика клеток Salmo-nella typhimurium в условиях голодания по субтрату с применением метода лантаноидного контрастирования и СЭМ» — тема доклада Н.Е. Гоголевой (ФГБУН «КИББ КазНЦ РАН», Казань). Лантаноидное контрастирование получило признание в микробиологии не только как быстрый метод пробоподготовки образцов, но и как метод, позволяющий визуализировать и оценивать основные морфологические структуры бактериальных клеток, включая их форму, размеры, относительное положение, капсулу, полифосфатные включения, перегородки во время их деления, а также внеклеточный матрикс. Известно несколько механизмов захвата и осаждения лантаноидов в биологических системах, один из которых определяется способностью замещать кальций в обменных цепях, второй — способностью активно связываться со свободными фосфатными остатками.
В обоих случаях связывание лантаноидов происходит в наиболее энергопотребляющих участках живой клетки. Исходя из этого, указывает автор, можно предположить, что лантаноидное контрастирование может служить маркером активности метаболизма. Лантаноидное контрастирование также способно давать некоторые характеристики физиологического состояния микроорганизмов. Для выяснения того, какие именно транспортные системы активны и могут насыщаться неодимом, авторами был проведен транскриптомный анализ клеток на разных стадиях роста. Детально были проанализированы гены двух транспортных систем, которые вносят наибольший вклад в транспорт фосфата. Прежде всего, это фосфат-специфичная транспортная система PST. Как было подтверждено экспериментально, система активируется в условиях голодания по фосфору. При этом неорганический фосфат захватывается белками-переносчиками и активно переносится внутрь клетки. Ко второй системе относится глицерин-3-фосфат транспортер. В этой системе фосфат транспортируется вовне клетки. Транскриптомный анализ показал, что обе эти системы имеют максимум активности на логарифмической стадии роста сальмонеллы, когда клетки бактерий связывают наибольшее количество лантаноида. Косвенно это указывает на тропизм лантаноидов именно к фосфатам. Для подтверждения данного наблюдения была использована дополнительная модель, которая представляет собой бактериальные культуры, персистирующие в условиях голодания по фосфору и углероду с разной плотностью клеток. Для этих культур был проведен детальный транскриптомный анализ, результаты которого были сопоставлены с данными по лантаноидному контрастированию.
В зависимости от плотности культуры, бактерии переходят в состояние покоя или реализуют программу активного стрессового ответа.
В соответствии с этим, наблюдается активное поглощение лантаноида или отсутствие свечения на микрографиях. При этом недостаток фосфата компенсировался высокой активностью его переносчиков и соответствующих генов.
По мнению авторов, неожиданным оказался результат, показавший незначительную корреляцию связывания лантаноидов с активностью кальциевой транспортной системы. При этом в голодающих культурах различий в активности генов кальциевых транспортеров не было выявлено.
Тем не менее взаимодействие лантаноидов с фосфаттранспортной системой у бактерий как маркер метаболической активности бактериальной клетки требует дальнейшего изучения.
Е.В. Кечин (ФГАУ «НМИЦ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова», Москва) от группы авторов представил доклад на тему «Сканирующая электронная микроскопия и оптическая 3D цифровая микроскопия в оценке морфологии роговицы после формирования роговичного клапана с использованием отечественной и зарубежной фемтолазерных установок». Цель исследования заключалась в проведении сравнительной оценки качества поверхности стромального ложа роговицы и морфометрических параметров роговичного клапана, сформированных с использованием отечественной («Фемто Визум») и зарубежной (Femto LDV Z6) фемтолазерных установок. Результаты исследований показали, что в эксперименте на кадаверных глазах человека отечественная и зарубежная фемтолазерные установки обеспечили формирование роговичных клапанов с регулярным характером толщины, правильной круглой формой, гладкой поверхностью стромального ложа и с четкой Z-формой угла вреза края. Статистически значимая разница между обеими установками отсутствует.
Доклад «Электронная микроскопия в оценке структуры стекловидного тела» от группы авторов представил д.м.н. С.И. Харлап (ФГБНУ «НИИГБ», Москва). Стекловидное тело (СТ) — одна из основных оптических структур глаза, которое, кроме оптических функций, несет «скелетную», морфологическую функцию. От состояния стекловидного тела зависит состояние всего глаза и практически всех его функциональных и морфологических структур.
У 8 человек при помощи электронной микроскопии были исследованы взятые во время оперативного вмешательства (витреоэктомия) объемы (до 0,5 мл) фрагментов из переднего отдела стекловидного тела. Материал был изучен с использованием системы химического микроанализа Oxford X — max 50. Исследование было осуществлено в течение 36-48 часов после его «забора» во время операции. До проведения электронной микроскопии материал хранился в «шприце для инсулина» в условиях гипотермии.
Изучение фрагментов стекловидного тела проводилось по оригинальной методике (И.А. Новиков) и в качестве первого этапа включало размещение изучаемого «фрагмента» на углеродной ленте и его последовательное разведение сначала в физрастворе, затем — в дистиллированной воде. Затем осуществлялось «вытягивание» из фиксированной «капли» структурных элементов, которые в последующем фиксировались и анализировались посредством осмотра под «большим» увеличением.
Использование оригинальной методики пробоподготовки гиалоидных фрагментов позволило выявить связанные между собой микроструктурные элементы в подвижной массе СТ. Для визуализации связанных гиалоидных элементов СТ использовался сканирующий электронный микроскоп Zeiss Evo LS10. Данные о морфологии наблюдаемых объектов были получены с помощью детекторов вторичных (VPSE) и обратно-рассеянных (BSD) электронов.
По мнению авторов, предварительные результаты исследования гиалоидных фрагментов у пациентов с астероидным гиалозом при помощи электронной микроскопии указывают на необходимость дальнейшего изучения прижизненного состояния СТ. Это позволит посредством анализа пространственного взаимного расположения «минеральных» элементов расширить природу отдельных фрагментов, а также уточнить морфологию СТ и оценить его прижизненное состояние в различных клинических ситуациях.
И.В. Вахрушев (ФГБНУ «НИИБМХ им. В.Н. Ореховича», Москва) от группы авторов выступил с докладом «Визуализация мезенхимальных стромальных клеток (МСК) на 2D и 3D носителях с применением лантаноидного контрастирования». Тканевая инженерия — это процесс создания трехмерных структур, способных выполнять функции той или иной естественной ткани организма на основе комбинации клеток и носителей клеточного материала (скаффолдов), а также прочих факторов, оказывающих влияние на рост клеток, их дифференцировку и организацию внеклеточного матрикса. Лантаноидное контрастирование позволяет сохранить нативную морфологию МСК как в 2D-культурах, так и в трехмерных условиях; повышает информативность СЭМ-исследований тканеинженерных конструкций; значительно ускоряет процесс подготовки препаратов.
С заключительным докладом на тему «Элементный состав плаценты при доношенной и недоношенной беременности по данным энергодисперсного рентгеновского микроанализа на базе СЭМ» от группы авторов выступила Е.С. Соловьева (ГБОУ ВПО «СГМУ», Смоленск). Цель исследования заключалась в изучении содержания химических элементов в биопробах плацент родильниц на сроках гестации 39-40 и 24-35 недель. Забор материала плацент осуществлялся в пяти локализациях: хориальной и базальной пластине, паренхиме плаценты, пуповине и оболочках плаценты. При оценке элементного состава плаценты использовался энергодисперсионный (ЭДС) рентгеновский микроанализ на базе СЭМ. Метод позволяет проводить анализ сложных неоднородных образцов с предварительной визуализацией; изучение химического состава поверхности биологического образца в режиме низкого вакуума; метод не требует дополнительной химической обработки, глубокого обезвоживания и напыления токопроводящими материалами.
Анализ результатов исследования показал, что в биоптатах плаценты на сроках 39-40 недель наблюдается тенденция к увеличению содержания в пробе общего кислорода на фоне снижения содержания в ней углерода. Сравнительный анализ элементного состава плаценты при доношенной и недоношенной беременности показал достоверно более низкое общее содержание кислорода в плаценте на сроках гестации 24-35 недель. Установлены достоверно значимые различия массовых долей химических элементов: кислорода (2-я, 3-я точки забора материала), азота (5-я точка), кальция (3-я точка), калия и фосфора (4-я точка) на разных сроках гестации. Полученные результаты в сочетании с наличием большого количества выбросов в четвертой точке забора материала (пуповинная часть плаценты) при недоношенной беременности на этапе предварительной обработки материала требуют дальнейшего изучения и объяснения.
Подготовил Сергей Тумар
Фотографии Сергея Тумара
Страницы: 1 2