После доклада последовали вопросы участников семинара. Исследования, представленные Эриком Хаммелом, привлекли внимание как молодых сотрудников ФГБУ «НИИГБ» РАМН, так и именитых специалистов. К удивлению немецкого гостя, доктор медицинских наук Татьяна Николаевна Сафонова задала вопрос на родном языке докладчика. Ее заинтересовало, почему именно диоксид титана и его взаимодействие с клеточными структурами стали объектом изучения. Эрик Хаммел ответил, что исследование было проведено по просьбе заказчика, которому было важно исследовать данное соединение.
Был вопрос и от молодого ученого Василия Дмитриевича Ярцева о будущем световой микроскопии в связи с активным развитием электронной микроскопии. Докладчик ответил, что это не взаимоисключающие методы. И необходимо делать шаги в области корреляции световых методов исследования биологических образцов с ультраструктурными методами на приборах более нового поколения.
Следующий докладчик, доктор Питер Гнаук, старший специалист департамента развития компании Carl Zeiss, рассказал о новых достижениях в использовании гелий-ионной микроскопии, которая открывает совершенно новые возможности для исследования биологических тканей. На слайде портфолио продукции фирмы Carl Zeiss гелий-ионный микроскоп стоит выше всех остальных приборов в связи с тем, что он позволяет добиться совершенно нового, более глубоко разрешения при изучении образцов. Для примера: если световая микроскопия дает разрешение 2-3 нанометра, электронная микроскопия — около 1 нанометра, то гелий-ионная микроскопия — 0,2-0,5 нанометров, что позволяет наблюдать и изучать гораздо более мелкие детали структур. Доктор Гнаук начал свой доклад с принципов работы гелий-ионного микроскопа. Его основным отличием от сканирующего электронного микроскопа является использование ионов гелия вместо пучка электронов. Из плюсов гелий-ионной микроскопии следует отметить: высокое боковое разрешение, поверхностную чувствительность, большую глубину резкости и, что очень важно, образец под таким воздействием не заряжается. Гелий-ионный микроскоп дает возможность работать на очень больших рабочих расстояниях. Далее докладчик остановился на основах полевой ионной микроскопии, являющейся прародителем гелий-ионной микроскопии, рассказал о принципах работы этого прибора, детально проанализировал возникающие ошибки и аберрации при сканирующей электронной микроскопии, рассмотрел пути исправления этих ошибок при гелий-ионной микроскопии. Доктор Гнаук на примере частиц карбида золота подробно объяснил, почему получается изображение с высоким разрешением при воздействии именно пучка ионов гелия в сравнении с пучком электронов. В качестве примеров работы на данном микроскопе докладчик представил исследования по образованию гидроксилапатита на поверхности волокон полимера.
Доктор Гнаук привел очень интересный пример проникновения вирусов в клетки. Изображения позволяют рассмотреть многие поверхностные детали вирусов, элементы структуры. Образец смотрится без напыления и при этом не заряжен. На следующем слайде докладчик показал раковые клетки с последующим увеличением отдельных деталей под большим увеличением и высоким разрешением.
В заключение доктор Гнаук представил еще одну работу — исследование почек. И, конечно, в сравнении с электронной микроскопией гелий-ионная имеет огромное преимущество в связи с возможностью давать сфокусированное изображение очень рельефной боуменовой мембраны во всем поле зрения, а не только в центральной части, как при воздействии электронным пучком. Безусловно, все слушатели были поражены возможностями прибора нового поколения гелий-ионного микроскопа.
Эстафету выступлений подхватили российские специалисты.
Доклад старшего научного сотрудника ФГБУ «НИИГБ» РАМН Ивана Александровича Новикова был посвящен особенностям проведения химического анализа биологических тканей с использованием сканирующего электронного микроскопа. Оказалось, что если в других направлениях естественных наук методы исследования химического состава детально проработаны, то в медицинских и биологических исследованиях методическая работа только начата. Более того, докладчику удалось доказать, что невозможно прямое переложение методов химического микроанализа из смежных дисциплин.
В докладе были рассмотрены особенности биологических объектов, влияющие на точность определения химического состава. Были определены «метрологический» и «качественный» подходы.
И.А. Новиков последовательно рассмотрел основные факторы, исключающие проведение количественного химического анализа биологических тканей с использованием энергодисперсионного спектрометра и сканирующего электронного микроскопа, но одновременно рассказал о возможности корректной качественной оценки изменений концентраций химических элементов в объеме образца.
В докладе были продемонстрированы приемы, позволяющие снизить погрешность измерений. Дополнительно автор представил оригинальную систему математической обработки сигнала, позволяющую оценивать распределение тяжелых микроэлементов в тканях, что ранее считалось невозможным при использовании СЭМ. Для поиска метода уточнения анализа автору пришлось рассматривать проблему «фундаментального химизма» жизни, чтобы исключить присутствие в пробе некоторых химических элементов.
Несколько приведенных примеров, в частности, «карты» распределения микроэлементов в опухоли кожи, а также в роговице при развитии кератоконуса, доказали работоспособность совокупности разработанных в НИИ методик.
Несмотря на методический характер доклада, он вызвал интерес слушателей конференции. Единственный в России специалист, изучающий связь биомеханических свойств склеры глаза с ее микроэлементным составом — доктор биологических наук, профессор Елена Наумовна Иомдина (Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца), расспрашивала автора про целесообразность проведения химического анализа на сканирующем электронном микроскопе. Был задан вопрос о минимальном увеличении при химическом микрокартировании образцов. Как ни странно, до появления последнего поколения сканирующих электронных микроскопов, стояла проблема минимальных рабочих увеличений, позволяющих оценивать химическую изменчивость в «масштабе ткани», а не на клеточном уровне.
С завершающим семинар докладом выступила старший научный сотрудник ФГБУ «НИИГБ» РАМН Ирина Геннадьевна Грибоедова.
Невероятно, но оказалось, что все приемы подготовки биологических тканей к сканирующей электронной микроскопии разработаны в середине прошлого столетия! При этом сами электронные микроскопы изменились с тех пор достаточно существенно и даже позволяют «смотреть» биологические образцы без обработки (в нативном состоянии).
Докладчик отметила, что классические схемы подготовки биологической ткани приводят к возникновению необратимых искажений структуры. Удивительно, но эти слова уже звучали в начале конференции в докладах зарубежных гостей. Предварительно химически фиксируя и обезвоживая ткань, мы не можем быть уверены, что структура клеток, волокон и других ее элементов при последующем изучении отражает прижизненную форму. С другой стороны, при попытке «подсмотреть» структуру без подготовки контрастности биологического вещества оказывается недостаточно. Созданию «краски» на основе редкоземельных элементов для контрастирования клеточных мембран и был посвящен последний доклад семинара.
Ирина Геннадьевна раскрыла цикл подготовки ткани, включая выбор концентрации растворов на основе хлорида неодима, температуру и экспозиции при окрашивании.
В заключение докладчик продемонстрировала примеры микрофотографий. Слушатели семинара были очарованы красотой электронных изображений, получаемых после оригинального метода окрашивания. На изображениях была видна не только структура ткани, но и структура клеток, вплоть до клеточных органелл, что весьма обыкновенно для просвечивающего электронного микроскопа, но абсолютно невероятно для сканирующей электронной микроскопии.
Необходимо отметить, что аналогичных исследований в мире больше нигде не проводится, и «Лаборатория фундаментальных исследований в офтальмологии» является абсолютным лидером в данном вопросе.
Конечно, по окончании доклада из зала посыпался целый шквал вопросов и предложений. Среди них можно выделить положительный отзыв об исследовании, сделанный профессором И.П. Хорошиловой-Масловой (Московский НИИ глазных болезней им. Гельмгольца), стоявшей у истоков сканирующей микроскопии в офтальмологии.
Отвечая на вопрос Елены Наумовны Иомдиной о глубине сканирования ультраструктуры под поверхностью образца, докладчику пришлось еще раз вернуться к обсуждению режимов съемки образцов.
Закрывая семинар, директор ФГБУ «НИИГБ» РАМН, академик РАН Сергей Эдуардович Аветисов, пожелал участникам дальнейших успехов. Он сделал предположение, что это был далеко не последний семинар, посвященный электронной микроскопии, который проходил в стенах института.
Материал подготовил И.А. Новиков, старший научный сотрудник ФГБУ «НИИГБ» РАМН
Страницы: 1 2
