Секция «Фундаментальные исследования»
Научную часть форума открыл программный доклад профессора М.С. Хайдакова (США). В течение последних 10 лет произошло много перспективных прорывов, но к которым следует относиться с некоторой осторожностью. В 1908 году И.И. Мечников получил Нобелевскую премию за открытие иммунитета (фагоцитоза), он является отцом современных пробиотиков, создателем термина «геронтология» ‒ науки о старении (1903).
Профессор М.С. Хайдаков (США)
С 1910-х до 1950-х годов ожидаемая продолжительность жизни (ОПЖ) увеличилась с 47 лет до 70. «Однако геронтологи, к сожалению, не имеют к этому отношения. Это –санитария и личная гигиена; уменьшилась детская смертность, появились антибиотики. После этого «великого события» прирост ОПЖ стал значительно ниже, потому что мы в определенной степени достигаем биологического предела для нашего вида».
Страны, в которых ОПЖ составляет 85 лет: Канада, Западная Европа, Чили, Австралия, Новая Зеландия, Япония.
В России ОПЖ среди мужчин составляет 67 лет, женщин – 77 лет.
Сто лет тому назад наиболее типичные причины смерти были связаны с инфекциями. По данным на 2016 год среди наиболее частых причин смерти не упоминаются туберкулез, нефрит, диарея, сифилис, детские болезни; остались сердечно-сосудистые заболевания; появились: хроническая недостаточность легких, диабет, болезнь Альцгеймера, терминальные заболевания почек, самоубийства.
«Исходя из опыте прошлого столетия, у вас может возникнуть мысль: «Если мы справимся и с этими заболеваниями, продолжительность нашей жизни значительно увеличится. Мы же справились с инфекционными заболеваниями и достигли при этом блестящих результатов. Однако, обратим внимание на возраст постановки диагноза (заболевания почек, диабет, инсульт, инфаркт миокарда, рак простаты, рак легких, рак кишечника, Альцгеймер): за исключением диабета он попадает в узкие пределы между 60 и 70 годами. Из этого следует, что, справившись с одной болезнью, мы столкнемся с ожидающими свой очереди другими «заболеваниями-убийцами».
Обратимся к исследованию, проведенному в США. Если мы избавимся от всех сердечно-сосудистых заболеваний, мы в среднем получим всего 6 дополнительных лет; если избавимся от рака, получим «жалкие» 3 года, избавление от Альцгемера даст менее 2-х месяцев.
Если мы рассматриваем болезнь как самодостаточное явление, логика не работает. Если смотреть на болезни как «на первые брызги гигантской волны глобального упадка», все обретает определенный смысл.
Рассмотрим кратко, что происходит с клетками в процессе старения. Судьба №1 – смерть. Утрата клеток имеет особое значение в популяциях, которые обновляются медленно или не обновляются. К ним относятся мозг, мышечные ткани, в определенной степени ‒ печень. Судьба №2 – рак. Это – один из драматических эффектов накопления мутаций, изменения эпигенетического профиля клеток. Судьба №3 – сенесцентность (сенесценс – старость), при которой старые клетки перестают выполнять свои функции, имея при этом повышенную сопротивляемость апоптозу; они остаются в популяции клеток, при этом ведут себя как сварливые соседи, отравляя жизнь своим все еще функционирующим коллегам. Судьба №4 – большинство «честных и законопослушных» клеток продолжают выполнять свои функции по мере уменьшающихся возможностей.
Такие же события происходят и в тканях глаза. К примеру, от 0 до 80 лет примерно половина клеток-аксонов сетчатки утрачивается навсегда.
Основные механизмы старения, о которых я скажу, ‒ это всего лишь верхушка айсберга. В теории старения их насчитывается около 400, из этого следует, что никто толком не знает, что по-настоящему происходит. Я выбрал накопление мутаций в ядерной ДНК, деградацию эпигенетического контроля, укорочение теломер, накопление мутаций в митохондриальной ДНК.
Мутации – это любые изменения последовательности исходной ДНК, они образуются в результате ошибок репликации или репарации, двух- или одноцепочечных разрывов, различных химических повреждений нуклеотидов, приводящих к нарушению комплементарности или рекомбинации; некоторые мутации происходят в кодирующих последовательностях генов и могут приводить к ухудшению или изменению функций соответствующих белков; ДНК содержится в двух компартментах: ядре (3,2 х 10⁹) и митохондриях (1,6 х 10⁴, 100-1000 копий на клетку).
В последнее время появились точные технологии, которые в состоянии определить количество накопленных мутаций в индивидуальных клетках. К 80 годам индивидуальные клетки накапливают до 5000 мутаций. Это не так страшно, т.к. гены составляют только 1% генома. Так как в генетическом коде существуют свои системы защиты, только треть мутаций имеют возможность изменить функцию белка. Одним из драматических проявлений накопления мутаций в некоторых клетках является появление рака, вероятность которого повышается с возрастом.
Я не вижу значительного числа клинических испытаний в США, направленных на вопросы репарации ДНК в качестве меры увеличения долголетия. Существует 6 систем репарации ДНК, но внутри нашего организма есть пример, позволяющий надеяться, что биологически это возможно. К примеру, стволовые клетки накапливают мутации со скоростью в 100 раз более низкой по сравнению с клетками других органов.
Эпигенетический контроль. Поскольку каждая клетка является гением, т.е. она располагает информацией, присущей всему организму, теоретически эта клетка может стать чем угодно. Однако, этого нельзя позволить, т.к. клетки должны дифференцироваться, специализироваться, выполнять различные функции, и эта проблема решается эпигенетическим контролем. Эпигенетический контроль играет роль смирительной рубашки, который строго ограничивает движение в одном месте и позволяет некоторую свободу движения в другом. Поэтому из клеток с абсолютно одинаковым генотипом образуются разные типы клеток. С возрастом эпигенетический контроль ухудшается, при этом скорость изменения эпигенетического контроля коррелирует с продолжительностью жизни различных животных.
В течение последнего десятилетия произошла настоящая революция: были открыты факторы Яманака (2007), которые позволяют стереть существующую эпигенетическую программу и вернуть клетку в стволовое (плюрипотентное) состояние. Доказана возможность перепрограммирования соматических клеток в другие клетки, причем перепрограммирование сопровождается омоложением; доказана возможность омоложения любых клеток, включая сенесцентные клетки и клетки 100-летних долгожителей; доказана возможность частичного омоложения мышей. Факторы Яманака были экспрессированы в мышей, что практически вдвое увеличило продолжительность их жизни. Правда, в эксперименте использовали мышей с прогерией, это означает, что подобный эффект может не наблюдаться при использовании здоровых животных.
Нерешенные проблемы. При некоторой доле неопределенности появляется все больше доказательств того, что эпигенетические механизмы ответственны за формирование и сохранение памяти. Пока не существует экспериментальных данных о том, как эпигенетическое омоложение влияет на предшествующую долговременную память животных. Если долговременная память стирается, то мы не сможем применить эпигенетическое омоложение в мозге и, таким образом, его теоретический потенциал исчерпывается увеличением продолжительности здоровой жизни. Также как и мутации, дедифференциация является фундаментальным условием канцерогенеза, что предполагает повышенную вероятность формирования рака.
Таким образом, для нас существует чрезвычайно узкое терапевтическое окно, в пределах которого мы можем надеяться на безнаказанное использование эпигенетического омоложения.
Теломеры – концевые участки хромосом, состоящие из тысяч повторов короткой последовательности (TTAGGG у позвоночных). Теломеры защищают концы хромосом от слияния с соседними хромосомами и способствуют правильному распределению хроматид между дочерними клетками. Уменьшение теломер до критического уровня сопровождается остановкой деления клеток. Теломеры укорачиваются с каждым делением клеток, и длина теломер может сильно варьировать у различных животных (мыши – от 7 до 150 Kb, человек – 10-12 Kb). Степень укорочения теломер при делении клеток также может сильно отличаться у различных видов (мыши – до 7000 нуклеотидов, человек – 8-193 в год). С момента открытия теломер исследования показали, что реактивация генов, кодирующих теломеразу ‒ фермент, отвечающий за восстановление длины теломер, ‒ позволяет клеткам продолжать делиться, т.е. сохранять этот аспект клеточной молодости. Активация теломеразы и восстановление длины теломер являются типичными характеристиками многих форм рака.
В настоящее время в США популярно использование препаратов, якобы способствующих удлинению теломеров. Логика довольно простая и прямолинейная. Предполагается, что этот механизм позволит «хорошим» клеткам продлить свою жизнь, тем самым продлится жизнь человеческого организма. Это – оптимистичный сценарий. В реальности сценарий развивается следующим образом: мы можем позволить хорошо работающим клеткам продолжить свою жизнь, при этом из клетки высвобождается гигантское количество предраковых клеток. Таким образом, эксперимент с теломеразой и ее активацией на мышах приводил к укорочению продолжительности жизни и существенному увеличению рака у этих животных.
Тем не менее, исследования с теломеразой, проведенные испанским ученым Марией Бласко, мировым авторитетом в этой области, показали, что возможно увеличить продолжительность жизни мышей на гигантские 40%, но при условии, что мыши будут защищены от рака.
Защита от рака обеспечивается чрезмерной активацией трех дополнительных генов, контролирующих деление клеток, что в принципе невозможно сделать в отношении человека.
Нерешенные проблемы. Удлинение теломер у человека может привести к сохранению тысяч предраковых клеток. В частности, оригинальные эксперименты по активации теломеразы и удлинению теломер сопровождались резким повышением частоты рака – как и следовало ожидать. Следовательно, такой подход не может быть использован без предшествующей нейтрализации накопления мутаций и эпигенетических изменений.
Мутации в мтДНК. Митохондрии – основные поставщики биологической энергии для клеточных процессов. Каждая клетка имеет сотни, иногда тысячи митохондрий в зависимости от потребности в энергии. Каждая митохондрия содержит от 1 до 10 копий мтДНК; каждая клетка содержит сотни или тысячи копий мтДНК; скорость накопления мутаций в мтДНК примерно в 10 раз выше, чем в ядерной ДНК; некоторые мутации проходят через процесс клональной экспансии (генетический дрейф), в результате которого большинство копий мтДНК в клетке содержит одинаковую мутацию (гомоплазмия); когда мтДНК с мутацией достигают 70-90% большинства, клетки утрачивают способность к аэробному метаболизму и становятся респираторно-дефицитными, что отражается на их функции и жизнеспособности. Это не является большой проблемой в молодом возрасте, т.к. весь процесс занимает десятилетия. Первые респираторно-дефицитные клетки появляются в районе 60 лет, со временем их количество возрастает. В таких тканях, как мозг и мышцы, до 30% клеток стареющих людей не в состоянии использовать кислород и испытывают энергетический кризис.
Глаз демонстрирует подобные феномены. Например, экстраокулярная мышца накапливает митохондриальные мутации в большей степени (в 3-4 раза) по сравнению со скелетными мышцами.
Основные заключения: старение сопровождается переходом от генетической и эпигенетической однородности к формированию мозаики разнообразных отклонений на уровне индивидуальных клеток; в силу утраты однородности реакции стареющих органов и тканей на регулирующие сигналы становятся аберрантными; основные механизмы старения демонстрируют признаки относительной синхронности в достижении критического уровня деградации, и поэтому маловероятно, что даже успешное воздействие на отдельный механизм приведет к существенному увеличению продолжительности жизни.
Современные подходы к антистарению и их использование в офтальмологии: здоровый образ жизни; сенолитики, стволовые клетки, эпигенетическое омоложение.
Физические упражнения. В анализ включены данные, охватывающие 650 000 человек. Физическая активность, эквивалентная быстрой ходьбе в течение 75 минут в неделю, была связана с увеличением ожидаемой продолжительности на 1,8 года. Более высокий уровень физической активности, эквивалентный 450 минутам в неделю, был связан с увеличением ОПЖ на 4,5 года. По сравнению с малоподвижными людьми, страдающими от ожирения (индекс массы тела ИМТ 35+) физически активные люди с нормальным весом (ИМТ в пределах 18,5 – 24,9) могут рассчитывать на увеличение ОПЖ на 7,2 года. То есть в совокупности здоровый образ жизни, хорошее питание и физическая нагрузка могут дать дополнительные 10-12 лет жизни.
Сенолитики – класс лекарственных препаратов и натуральных соединений, которые способны избирательно инициировать гибель постаревших (сенесцентных клеток). Сенесцентные клетки накапливаются в тканях стареющего организма. Сенесцентные клетки перестают выполнять первоначальные функции, обретают старческий секреторный фенотип SASP, выделяя во внеклеточную среду множество цитокинов, вызывающих воспаление, ускорение пролиферации и изменения во внеклеточном матриксе.
Стволовые клетки – подход, не требующий полного понимания процесса старения. Ряд лабораторий уже сообщили об успешной регенерации целых органов. Недавно ученым удалось вырастить функциональные ткани почек, сердца и даже мозга человека. Были проведены десятки различных успешных клинических испытаний, касающихся использования стволовых клеток для лечения ряда заболеваний, включая болезни сердца, остеоартрит, болезнь Альцгеймера и многих других.
Нерешенные проблемы: в пределах моего понимания у такого вмешательства нет фундаментальных недостатков, и его эффективность может быть легко проверена экспериментально; скорость накопления мутаций в стволовых клетках практически такая же, как и в соматических клетках, что создает опасность развития неоплазм; выживание, интеграция введенных стволовых клеток и их функционирование в целевых органах и тканях.
Заключительные выводы: фундаментальным аспектом большинства заболеваний сумеречного возраста являются накопление дефектов в исходных элементах конструкции органов и тканей (утрата клеток, мутации, утрата эпигенетического контроля, изменения композиции внутриклеточного матрикса, накопление отходов и т.д.); каждая стареющая клетка приобретает свою собственную уникальную коллекцию мутаций и других изменений и, следовательно, свою собственную уникальную форму явной (рак) или скрытой инвалидности; в результате возрастные патологии не могут быть полностью разрешены с помощью традиционных методов лечения. Таким образом, только терапии, направленные на базовые механизмы старения, дают надежду на излечение или предотвращение ВСЕХ заболеваний, обусловленных процессом старения, в том числе, заболеваний глаз.
С докладом «Атомно-силовая микроскопия в оценке возрастных изменений капсулы хрусталика и десцеметовой мембраны» выступил академик РАН С.Э. Аветисов (Москва). Вне зависимости от объекта исследования определение возрастных показателей является отправным, обязательным элементом любого биомеханического исследования.
Академик РАН С.Э. Аветисов (Москва)
Цель исследования заключалась в оценке возрастных изменений биомеханики капсулы хрусталика.
Основные преимущества атомно-силовой микроскопии (АСМ): не предполагает растяжения и деформации образца; принцип АСМ основан на взаимодействии заостренной иглы (зонда), находящейся на кончике балки (кантилевера), с поверхностью образца за свет сил притяжения и отталкивания, степень которых зависит от жесткости биоматериала; АСМ обеспечивает возможность селективной оценки биомеханических свойств различных поверхностей образца; в результате определяют модуль Юнга (модуль продольной упругости) – физическую величину, характеризующую свойство материала сопротивляться растяжению/сжатию при упругой деформации; возможно получение фазово-контрастных изображений поверхности образца с высоким разрешением.
Задачи исследования: оценка потенциального влияния субкапсулярного эпителия на результаты АСМ; оценка возрастных изменений биомеханический показателей капсулы хрусталика.
Материал исследования: 50 центральных фрагментов передней капсулы хрусталика, полученных интраоперационно в результате мануального капсулорексиса у пациентов в возрасте 49-93 лет (время хранения в балансированным растворе до проведения тестов не более 5 часов).
Разработанный алгоритм АСМ включал следующие основные этапы: микроскопия наружной и внутренней; поверхности образцов передней капсулы; идентификация внутренней поверхности образца на основе визуализации субкапсулярного эпителия; проведение биомеханических тестов в участках внутренней и наружной поверхности для селективного определения модуля Юнга.
Результаты: независимо от возраста жесткость внутренней поверхности капсулы оказалась выше, чем наружной; возрастные изменения капсулы хрусталика проявляются в увеличении модуля Юнга наружной поверхности и уменьшении внутренней (т.е. в повышении и снижении жесткости соответственно; при увеличении возраста отмечено достоверное снижение соотношения модулей Юнга внутренней и наружной поверхности капсулы.
В заключение академик РАН С.Э. Аветисов отметил необходимость дальнейшего изучения изменений биомеханических свойств капсулы хрусталика в качестве одной из причин возрастных нарушений аккомодации.
Профессор С.А. Борзенок (Москва) от группы авторов представил доклад на тему «Методические подходы к конструированию искусственной роговицы на основе 3D клеточных сфероидов и полимерных материалов». По данным ВОЗ, заболевания роговицы занимают 4 место в структуре инвалидности по зрению. При помутнениях роговицы применяются сквозная и селективная послойная кератопластики с использование трупной донорской роговицы. В наиболее тяжелых случаях применяется кертопротезирование, при этом во всем мире наблюдается дефицит качественного трубного материала для трансплантации роговицы.
В ряде стран мира проводятся исследования по биоинженерному конструированию искусственной роговицы, которая обладала бы оптимальными прочностными, оптическими и трансплантационными свойствами, идентичными нативной роговице. Основные проблемы при создании искусственной роговицы: получение клеточных культур переднего эпителия, стромы и эндотелиальных клеток роговицы с сохранением их специфических морфофункциональных свойств. Стромальный слой искусственной роговицы должен соответствовать архитектонике, механической прочности, прозрачности и оптическим свойствам нативной, однако возможность сочетания этих факторов ограничивает выбор традиционно используемых биологических материалов. Одним из таких материалов является фиброин шелка, обладающий биологической инертностью, прозрачностью и биодеградируемостью. Задаваемая толщина пленок из фиброина позволяет создавать слоистую структуру с поэтапным заселением клетками и последующим замещением собственным коллагеновым матриксом после трансплантации.
В 2021 году были опубликованы 5-летние результаты трансплантации предварительных культивированных эндотелиальных клеток роговицы 11 пациентов. У всех пациентов восстанавливалась или практически восстанавливалась прозрачность роговицы, ее толщина в центре составляла 550 мкм.
Многоклеточные сфероиды представляют собой объемную форму 3D культур, в которых клетки приближены к условиям нативной ткани и являются наиболее предпочтительными для тканевой трансплантации в сравнении с 2D – плоскостными клеточными культурами.
Цель исследования – разработка методологических подходов к конструированию искусственной роговицы на основе культивированных клеток трупной донорской роговицы в виде 3D клеточных сфероидов и полимерных материалов.
Исследования показали, что методы выделения и культивирования клеток переднего эпителия, стромы и роговицы, формирования жизнеспособных 3D сфероидов из этих клеток с сохранными морфофункциональными характеристиками, подбор оптимального биосинтетического материала для стромального скаффолда – фиброина шелка, могут стать методологической основой для дальнейших исследований по биоинжинирингу полноценного искусственного эквивалента донорской роговицы человека для трансплантации.
Д.м.н. Н.Л. Шеремет (Москва) от группы авторов выступила с докладом «Экспериментальное моделирование повреждающего воздействия на пигментный эпителий сетчатки». Дегенеративные изменения ретинального пигментного эпителия (РПЭ) возникают при многих наследственных и приобретенных заболеваниях сетчатки. Возможности терапевтического лечения для восстановления РПЭ и его связей с прилежащими фоторецепторами отсутствуют. Наиболее перспективным методом лечения является хирургическая трансплантация РПЭ. Одним из источников клеток для трансплантации может быть РПЭ, дифференцированный in vitro из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК).
Д.м.н. Н.Л. Шеремет (Москва)
Для экспериментального изучения возможности лечения сетчатки были разработаны способы моделирования повреждения РПЭ на животных с помощью химического повреждения) гидрохлорид L-орнитин, натрий йодат, каиновая кислота, N-мети-N-нитрозомочевины), механического и светового (повреждение голубым светом, аргоновый и гелий-неоновый лазер) повреждения. Экспериментальные животные: мыши, крысы, кролики, нокаутированные животные.
В последнее время для моделирования повреждения РПЭ применяется трансвитреальное субретинальное введение кроликам фосфатбуферного раствора или солевого сбалансированного раствора. Это вызывает выраженную дегенерацию фоторецепторов и изменения РПЭ; интеграция суспензии ПСК на модели кролика с предварительно индуцированной географической атрофией отсутствует в связи с повреждением внешнего комплекса фоторецепторы/РПЭ/МБ; ПСК в суспензии могут правильно интегрировать, только если субретинальная среда достаточно сохранена; следует выбирать модели дегенерации сетчатки, которые будут соответствовать ранним стадиям заболевания, с относительно сохранной наружной сетчаткой.
Цель работы: моделирование повреждающего воздействия на РПЭ у животного для последующего изучения влияния нейрональных предшественников (НП) человека. Исследование проведено на 31 кролике (31 глаз) породы шиншилла.
Исследования показали, что в результате возрастной, наследственной дистрофии или моделированной в эксперименте дегенерации наружных слоев сетчатки происходит повреждение и гибель ряда специализированных клеток нейроэпителия сетчатки глаза; сохранность зрительного нерва и потенциально возможное восстановление физиологических взаимосвязей между различными типами клеток сетчатки предоставляет возможность для применения заместительной терапии поврежденных клеточных структур; источником материала для заместительной терапии в этом случае могут служить неспециализированные клетки нейроэпителия, которые обладают дифференцировочным потенциалом для формирования таких типов клеток, как пигментный эпителий и фоторецепторы. В связи с этим является целесообразным дальнейшее изучение влияния дифференцированных in vitro нейрональных предшественников, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, при повреждении РПЭ и ФР.
