Протеомный анализ жидкости передней камеры глаза при катаракте, первичной открытоугольной глаукоме и псевдоэксфолиативном синдроме

Н.И. Самохина^1,2, С.А. Кочергин^2
1Филиал № 1 «Офтальмологическая клиника» ГБУЗ ГКБ им. С.П. Боткина ДЗМ;
²Кафедра офтальмологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России

Протеомный анализ является одним из новых направлений исследований состава биологических жидкостей. Основным предметом изучения протеомики являются белки, их функции и взаимодействия в живых организмах, а главная ее задача — количественный анализ экспрессии белков в клетках в зависимости от их типа, состояния или влияния внешних условий [1].

В последние годы протеомный анализ стал неотъемлемой частью биомедицинских исследований [4]. Главной целью клинической протеомики является обнаружение нового белкового или пептидного биомаркера, который связан с определенным заболеванием. Кроме того, если такие белки уже известны, анализ протеома может использоваться как метод ранней диагностики.

В последнее время метод протеомного анализа приобретает большую актуальность и в офтальмологии. С помощью масс-спектрометрии была исследована слеза и жидкость передней камеры глаза, забор которых осуществлялся при различных заболеваниях [10-13].

Цель исследования — определить протеомный состав жидкости передней камеры и его различия при катаракте, первичной открытоугольной глаукоме и псевдоэксфолиативном синдроме.

Материалы и методы

Под наблюдением находились 29 пациентов. Возраст пациентов — от 45 до 82 лет. 1-ю группу (контрольную) составили пациенты с катарактой (11 человек), не имеющие другой офтальмопатологии. Во 2-ю группу вошли пациенты с катарактой и псевдоэксфолиативным синдромом без подтвержденного диагноза глаукома (5 человек). 3-ю группу составили пациенты с катарактой и открытоугольной глаукомой (7 человек). В 4-ю группу вошли пациенты с катарактой, ПОУГ и ПЭС (6 человек).

В исследование включались пациенты, не имеющие тяжелых соматических заболеваний, хронических системных заболеваний, не переносившие за последний год лазерные операции на исследуемом глазу и не имеющие в анамнезе хирургических вмешательств на глазном яблоке.

Пациентам всех групп проводилось комплексное офтальмологическое обследование и забор жидкости передней камеры для проведения протеомного исследования.

Офтальмологическое обследование включало визометрию, периметрию, тонометрию, гониоскопию, биомикроскопию, прямую и обратную офтальмоскопию, оптическую когерентную томографию, ультразвуковое В-сканирование, пахиметрию, определение критической частоты слияния мельканий.

Забор жидкости передней камеры проводился во время первого этапа операции факоэмульсификации катаракты в филиале № 1 ГКБ им. С.П. Боткина «Офтальмологический стационар». Жидкость передней камеры глаза исследовалась техникой протеомного анализа при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с высокоточной тандемной масс-спектрометрией. Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на приборе Agilent 1100 Series (Agilent Technologies, США).

Тандемный масс-спектрометрический анализ проводили на приборе Orbitrap Q Exactive (Thermo Scientific, США). Лабораторные исследования проводились на базе Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича» (ИБМХ).

В исследование были включены 29 образцов жидкости передней камеры глаза. Для каждого образца проводилась высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с высокоточной тандемной масс-спектрометрией в трех технических повторах. Биоинформатический анализ полученных спектров проводился с использованием программы MaxQuant версии 1.5.2.8. Полученный список белков имел уровень ложноположительных результатов (FDR) = 1%, как для белковых, так и для пептидных идентификаций, что было получено путем сопоставления результатов с инвертированной базой данных.

Результаты

Белки жидкости передней камеры глаза получены в результате протеомного анализа. Анализ аннотации белков жидкости передней камеры глаза проводился с помощью Gene Ontology. Gene Ontology или GO — это важный биоинформационный проект, посвященный созданию унифицированной терминологии для аннотации генов и генных продуктов всех биологических видов. GO является частью более крупного проекта Open Biomedical Ontologies (OBO) [35-37].

Для определения уровня значимости обогащения использовали расчет значений p-value по формуле гипергеометрического распределения или мультивариантого гипергеометрического распределения, которое в теории вероятностей моделирует количество удачных выборок без возвращения из конечной совокупности. Наиболее значимыми считали биологические процессы с наименьшим значением p-value. Например, уровень значимости обогащения p=8,7710-44 свидетельствует о высокой достоверности полученного результата.

В работе найдены 263 белковые группы, характеризующие протеом жидкости передней камеры глаза. Основная часть выделенных нами белковых групп отвечает за функцию связывания биологических молекул и тем самым осуществляет регуляцию клеточного ответа на различные сигналы, что важно для координации всех биохимических процессов, происходящих в жидкости передней камеры глаза.

Большая часть белков (148 из 263) была обнаружена во всех группах. В соответствии с классификацией Gene Ontology, большинство выделенных белковых групп участвует в регуляции протеолиза. К примеру, ингибитор эндопептидазы и регулятор пептидазы, выделенные в жидкости передней камеры, предотвращают развитие патологического протеолиза. По литературным данным, большинство белков, обнаруженных в жидкости передней камеры глаза, также выделены в плазме крови и спинномозговой жидкости [4].

Особый интерес представляют 26 белков, выделенных только в группе «катаракта». Среди них -кристаллин (идентификатор Gene Name CRYAA), витамин-K-зависимый белок (PROS1), корнеодесмосин (CDSN), плакофилин-1 (PKP1), -цепь тубулина (TUBA1B). По литературным данным, эти белки являются структурными составляющими вещества хрусталика и появляются в жидкости передней камеры при развитии катаракты [40, 41]. Авторы связывают появление белков-кристаллинов с биохимическими изменениями, происходящими при развитии катаракты.

Из 16 белков, характеризующих катаракту с псевдоэксфолиативным синдромом, впервые выявленными являются 6 белков. Среди них флавин-редуктаза (BLVRB), белок S100-A1 (S100A1), глутатион-S-трансфераза -3 (GSTM3), -1-цепь коллагена (COL18A1), рибонуклеаза-4 (RNASE4), десмин (DES). Для группы глаукомы найдено 12 уникальных белков. 4 из них являются впервые выявленными: аполипопротеин С-III (APOC3), -2-цепь коллагена (COL1A2), -3-цепь коллагена (COL9A3) пролин-богатый белок-4 (PRR4).

Из 4-х белков, характеризующих группу глаукомы с псевдоэксфолиативным синдромом, два являются впервые выявленным. Это F-бокс белок (NCCRP1) и НАД(Ф)Н-дегидрогеназа (NQO1).

7 белковых групп, найденных на пересечении множеств «катаракта + псевдоэксфолиативный синдром» и «глаукома + псевдоэксфолиативный синдром» позволяют выявить тенденции в различиях белкового состава при псевдоэксфолиативном синдроме. Основная функция этих белков — участие в связывании различных биологических молекул и регуляция метаболических процессов жидкости передней камеры глаза.

Среди белков жидкости передней камеры глаза по сравнению со всем протеомом человека чаще встречаются аннотированные, как обладающие активностью по ингибированию эндопептидаз (GO:0004866) (уровень значимости обогащения p = 9,7410-41), что свидетельствует о важности защиты жидкости передней камеры глаза от протеолиза. Основной молекулярный процесс, преобладающий среди протеома жидкости передней камеры глаза — каскад активации белков (GO:0072376) (уровень значимости обогащения p=8,7710-44), так как клеточный сигналинг очень важен для координации биохимических процессов клеток.

Анализ аннотации белков, «конститутивно» представленных в жидкости передней камеры глаза, по результатам нашей работы и ранее опубликованным данным, показал, что чаще встречаются белки, аннотированные как обладающие активностью по ингибиторованию эндопептидаз (GO:0004866) (уровень значимости обогащения p=1,7310-34).

Молекулярным процессом, преобладающим среди протеома жидкости передней камеры глаза, является негативная регуляция пептидазной активности (GO:0010466) (уровень значимости обогащения p=4,2910-32), важная для защиты жидкости передней камеры от протеолиза.

Заключение

В нашей работе были исследованы образцы жидкости передней камеры глаза

29 пациентов с катарактой, глаукомой и псевдоэксфолиативным синдромом методом хромато-масс-спектрометрии на приборе высокого разрешения.

Полученные данные позволяют оценить различия в белковом составе внутриглазной жидкости в представленных группах больных. В исследовании были идентифицированы группы белков, ранее неописанные в составе жидкости передней камеры. Также выявлены 4 уникальные группы белков, характерные для катаракты, псевдоэксфолиативного синдрома и глаукомы. Найдена тенденция в различиях состава протеома жидкости передней камеры глаза у больных с псевдоэксфолиативным синдромом и без него.

Анализ объединенного протеома водянистой влаги на предмет преобладания определенных структурно-функциональных групп белков с использованием категорий Gene Ontology выявил, что основной функцией белков жидкости передней камеры глаза является активность по ингибированию эндопептидаз.

Обнаруженные различия в белковом составе жидкости передней камеры свидетельствуют об изменении обмена веществ, что может являться одним из ключевых звеньев в патогенезе псевдоэксфолиативного синдрома и глаукомы.

Проведение протеомных исследований глазных жидкостей является перспективным, так как дает возможность разработки методов диагностики и лечения заболеваний глаза.

Литература

1. Anderson N.L., Anderson N.G. Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and new words // Electrophorresis. – 1998. – Vol. 19 (11). – P. 1853—1861.
2. Hu S., Loo J.A., Wong D.T. Human body fluid proteo-me analysis // Proteomics. – 2006. – Vol. 6. – P. 6326—6353.
3. Мошетова Л.К., Волков О.А. Современное представление о слезной жидкости, значение ее в диагностике // Клиническая офтальмология. РМЖ. – 2004. – Т. 5. – № 4. – С. 138-141.
4. Ethen C.M., Reilly C., Feng X. et al. The proteome of central and peripheral retina with progression of age-related macular degeneration // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2006. – Vol. 47. – P. 2280—2290.
5. Grus F.H., Podust V.N., Bruns K. et al. SELDI-TOF-MS Protein Chip array profiling of tears from patients with dry eye // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. – 2005. – Vol. 46. – P. 863-876.
6. Ohashi Y., Ishida R., Kojima T. et al. Abnormal protein profiles in tears with dry eye syndrome // Am. J. Ophthalmol. – 2003. – Vol. 136. – P. 291-299.
7. Gene Ontology Database. Gene Ontology Consortium.
8. Smith B., Ashburner M., Rosse C. et al. The OBO Foundry: coordinated evolution of ontologies to support biomedical data integration // Nat. Biotechnol. – 2007. – Vol. 25 (11). – P. 1251—1255.
9. Blake J.A., Dolan M., Drabkin H., et al. Gene ontology annotations and resources // Nucleic Acids Res. – 2013. – Vol. 41.
10. Horwitz J., Alpha-crystallin // Exp. Eye Res. – 2003. – Vol. 76. – P. 145-153.
11. Yi J., Yun J., Li Z.K. et al. Epidemiology and mole-cular genetics of congenital cataracts // Int. J. Ophthal-mol. – 2011. – Vol. 4. – P. 422-432.

Сборник научных трудов «190 лет. Московская глазная больница», Москва, 2016 г.