В продолжение темы профессор Zhu рассмотрел различные варианты экспрессии генов на гипоксию — острую и рецидивирующую. Докладчик подчеркнул, что экспрессию генов вызывают именно низкие дозы гипоксии. Уже через неделю после случившейся гипоксии не стоит ожидать какого-либо ответа на лечение. По этой причине активно изучаются различные фенотипы гипоксии с применением ЭФИ, в частности — повторяющаяся гипоксия: repetitive hypoxic preconditioning (RHP), например, на фоне курения и стрессов, когда имеет место повторяющаяся гипоксия, и, следовательно, любое нейропротекторное лечение будет действовать не так, как в случае острой гипоксии. В заключение доклада автор привел высказывание: «Что тебя не убивает, делает тебя сильнее…» Так, в следующем докладе было, например, показано, что гипергликемия задерживает неоваскуляризацию в экспериментальной модели.
На секции «Новое в визуализации при глаукоме» рассматривались новые технологии визуализации пигментного эпителия, внутренней пограничной мембраны и молекул, например, меланина.
В докладе A. Huang (ULCA: Stein Eye Inst. DOHENY) «OCT-A для визуализации переднего отрезка» речь шла о применении ОКТ-ангиографии для визуализации путей оттока внутриглазной жидкости. В эксперименте на животных авторы посредством этой технологии обнаружили некие каналы в склере, которые также участвуют в этом оттоке. Докладчик подчеркнул, что знание индивидуальных путей оттока важно с целью определения локализации антиглаукомных вмешательств.
В докладе H. Ishikava (Нью-Йорк) автор остановился на методах микровизуализации решетчатой мембраны склеры (РМ). Было продемонстрировано видео — процесс в динамике — с визуализацией пор, как они меняются при колебаниях ВГД. Измеряли отношение толщины перекладин к диаметру пор. При глаукоме это отношение возрастает, что важно учитывать для понимания изменения аксонального транспорта и кровотока в капиллярах, проходящих в РМС.
С точки зрения участия внутричерепного давления (ICP: intracranial Pressure) было подчеркнуто, что оно играет не меньшую роль, чем ВГД. (Wang, PLoS one, 2017)
Было показано видео в динамике, где было наглядно продемонстрировано, как эти две силы действуют на мембрану. Была создана geometric average — среднее изображение всех пор, т.е. математически обоснована такая модель изображения, на которой можно наблюдать, как изменяются поры РМС в ответ на изменение трансмембранного давления. Все эти исследования сделаны с помощью SWEPT-OCT. В довершение была показана карта распределения деформаций пор при повышении ВГД при глаукоме. В настоящее время ведутся разработки с целью внедрения этой технологии в программное обеспечение томографа Zirrus.
Доклад вызвал большую дискуссию. Были вопросы о том, как деформация пор зависит от стадий глаукомы и от длительности офтальмогипертензии. Пока ответов на эти вопросы нет.
Еще одно важное направление визуализации — адаптивная оптика. С докладом «Адаптивная оптика (АО) в визуализации ганглиозных клеток сетчатки (ГКС)» выступила профессор A. Dubra (Стэнфорд). J. Carrol, D. Gray описали АО в 2005 г. Сделав исторический экскурс, докладчик подчеркнула, что это направление в исследовании структур глаукомного глаза очень молодое, тем не менее уже есть работы по РМС (Nadler) и СНВС (Takayama, Kocaoglu). Hood описал тоннели во внутренних слоях сетчатки, соответствующие выпадению СНВС, что примечательно, расположенные в зоне крупных ретинальных сосудов. И только в прошлом году впервые этим методом были изучены ГКС (Ethan, Rossi, Sredar, Zhuilin, Liu). Авторы объединили метод адаптивной оптики с ОКТ, применив широкопольные изображения, что значительно повысило качество изображения ГКС. Наконец, появилась возможность визуализировать кровоток в ретинальных сосудах, вплоть до движущихся в них эритроцитов (A. Castro).
С применением адаптивной оптики впервые описаны микроцисты во внутреннем плексиформном слое, природа которых неизвестна, но установлено, что они являются ранними предикторами атрофии зрительного нерва любого генеза. Кроме того, метод позволяет визуализировать аксоплазматический ток. Таким образом, был сделан вывод, что адаптивная оптика — это не что иное, как метод, позволяющий проводить прижизненную микроскопию сетчатки и ее структур.
В заключение на симпозиуме был подведен итог о том, что современные методы визуализации обеспечивают разработку новых биомаркеров глаукомы, причем можно оценивать их в динамике. Эти биомаркеры: РМС, СНВС, ГКС и внутренний плексиформный слой.
В докладе, посвященном прижизненной визуализации апоптоза ГКС, профессор Ф. Кордейро рассказала о технологии DARC, которой уже более 10 лет, но лишь недавно была завершена первая фаза клинических испытаний этой технологии. Суть ее — визуализация раннего процесса повреждения мембран ГКС при апоптозе, что приводит к их свечению в условии введения красителя аннексина. Данный препарат вводится внутривенно, и уже в первые часы становится заметным свечение ГКС, которое усиливается к 4 и 6 часу. Было установлено, что уже при начальной глаукоме количество светящихся ГКС превосходит норму в 2,4 раза. Впервые было показано, что этот процесс ассоциируется с быстрым прогрессированием глаукомы, а также существенно тормозится на фоне лечения коэнзимом Q10. В настоящее время проводится вторая фаза клинических испытаний на пациентах с болезнью Альцгеймера, Паркинсона и при болезни Дауна.
На секции, посвященной многоцентровым исследованиям при глаукоме, профессор Шметтерер рассказал о недавно завершившемся сингапурском исследовании, проведенном на 3 тысячах обследуемых.
Целью данной работы было выявить связь между АД, ВГД и прогрессированием глаукомы. Докладчик подчеркнул, что в отличие от европейцев, у индусов и малазийцев с возрастом ВГД имеет тенденцию к снижению, что было подтверждено в данном исследовании. ВГД оставалось неизменным только при повышенном АД. При его нормальных и пониженных значениях ВГД неизменно снижалось. Данный феномен пока не удается объяснить, но, скорее всего, это связано с генетическими особенностями.
Много интересных докладов было посвящено генной терапии заболеваний сетчатки.
Докладчики обсуждали технические детали доставки данных препаратов под сетчатку при помощи специальных имплантов хирургическим путем. Было отмечено, что такие осложнения, как отслойка нейросетчатки, встречались довольно редко. Больше всего в настоящее время экспериментальные модели применяются с целью лечения пигментного эпителия, в частности, при пигментном ретините. Трансплантация клеток пигментного эпителия и имплантация генно-измененных фоторецепторов уже осуществлены в клинике, причем с хорошими результатами (оценивались электрофизиологические параметры). Доклады были представлены разными странами. Особый интерес вызывает британский проект «Тhe London Project to cure blindness», в рамках которого уже проведена имплантация искусственной мембраны Бруха при лечении влажной формы ВМД. Пациентов наблюдали в течение 3 лет. Были продемонстрированы сканы ОКТ отдаленного периода, на которых хорошо визуализировался трансплантат под макулой. В обсуждении результатов докладчик отметил, что они не наблюдали эпиретинального фиброза ни в одном случае. Планируется подобный проект при сухой ВМД.
Большой интерес вызвал доклад о ксенотрансплантации, когда трансплантаты готовили из клеток ганглиозного слоя кошек и пересаживали их людям под мощной иммуносупрессивной терапией (циклоспорин). Было отмечено, что процесс подготовки клеток занимал 90 дней и требовал тщательного отделения от микро- и макроглиальных структур. В ряде случаев был получен желаемый результат: пересажанные клетки не только приживались, но давали рост аксонов из трансплантата к тканям реципиента. Пока сроки наблюдения этого многоцентрового исследования, проведенного в США, ограничиваются пятью неделями.
В докладе из Gavin Herbert Eye Institute были освещены результаты интравитреального введения аллогенных прогениторных стволовых клеток (hRPCs: human Retinal Progenitor Cells) при пигментном ретините. Данная технология уже апробирована во второй фазе клинических исследований на 28 пациентах, которые наблюдались в течение года. Авторы подчеркивают необходимость повторных инъекций каждые 18 месяцев. В видеофильме было показано, что инъекции осуществлялись в условиях амбулаторной операционной в положении больного сидя. Результаты показали повышение зрения во всех случаях, причем был отмечен дозозависимый эффект. В качестве контроля использовали парный глаз, в который инъекции не выполнялись. 22 пациента уже получили повторное введение клеток. В настоящее время проводится многоцентровое исследование, охватившее 85 больных из Бостона и нескольких центров Южной Калифорнии, а сама технология находится на утверждении FDA. Очень удобно, что клетки могут храниться в холодильнике до 1,5 лет и предполагается коммерческое их использование в виде специальных имплантов.
В дискуссии, возникшей после этого доклада, слушатели уточняли, не вызывало ли введение стволовых клеток в стекловидное тело эпиретинального фиброза. Авторы ответили, что это не наблюдалось ни в одном случае. Предполагаемый механизм действия клеток — нейротрофический. Особо было подчеркнуто, что предварительно всем больным выполнялось уточнение фенотипа заболевания. Клетки вводились только тем пациентам, у которых можно было рассчитывать на положительный результат.
В докладах, посвященных генетическому лечению глаукомы, авторы из Университета Техаса обратили внимание на мутациях гена миоцилина, что приводит к его мисфолдингу, избыточной секреции и аккумуляции в трабекулах. Применение технологии Chemical/shaperon на основе CRISPR-Cas 9 на мышах показало улучшение оттока внутриглазной жидкости. Следует отметить, что, как и в случае лечения пигментного ретинита в предыдущем докладе, здесь также предварительно изучался фенотип заболевания. Далее ученые вывели специальную модель мышей для исследования патологии оттока, связанной с образованием экстраклеточного матрикса. В настоящее время созданы специальные модификации генов, направленные на снижение его синтеза, что открывает перспективы в гипотензивном лечении глаукомы.
С целью нейропротекторного лечения глаукомы также предлагается генная терапия на основе технологии CRISPR в лечении ГКС. Доклад был представлен Национальным институтом глаза США. Было подчеркнуто, что к апрелю 2018 г. идентифицировано 298 генов, мутации которых представляют интерес в этом плане. Важный аспект в этом направлении — совершенствование аденовирусных векторов с целью наиболее безопасной доставки их к сетчатке. Примечательно, что метод (Gene Augmentation approach) уже апробирован в лечении Леберовской атрофии и пигментного ретинита, что описано в публикации Wu в 2015 г.
Много новаторских идей в плане микроциркуляции сетчатки было высказано на сессии под названием «От микровизуализации до макрофункциональности». В докладе Harison из Канады «Реакция перицитов на изменения ВГД» обсуждалось изменение диаметра капилляров в ответ на повышение офтальмотонуса. Этот диаметр исследовался в течение 3 недель, а скорость кровотока в мелких сосудах измерялась в эритроцитах в секунду. Использовали двухфотонную микроскопию и обнаружили, что офтальмогипертензия приводит к транзиторной ишемии в отдельно взятом капилляре (это было продемонстрировано в видеофильме, снятом на мышах в динамике в течение 2 недель). Введение ионов Са2+ увеличивало сокращение перицитов и капилляров. Было показано, что снижение ВГД на 2 часа бринзоламидом не оказывало никакого влияния на спазмированные капилляры, причем их сужение сохранялось даже через 3 недели. Доклад вызвал бурное обсуждение, т.к. многие патофизиологические аспекты, описанные в этой работе, пока труднообъяснимы.
В докладе из Страсбурга была предложена математическая модель, показавшая, что изменение ВГД и трансмембранного давления на уровне решетчатой мембраны склеры не оказывает влияния на артериальный кровоток, но существенно изменяет кровоток в венозном русле глаза.
В докладе профессора Н.И. Курышевой были представлены данные о снижении макулярного кровотока на ранних этапах глаукомного процесса, а также о связи этих изменений с кровотоком в глазной артерии, центральной артерии сетчатки, задних коротких цилиарных артериях и венозном русле глаза.
Все заседания проходили в обстановке большой заинтересованности аудитории, доклады сопровождались бурными дискуссиями, которые из залов переходили на территорию постеров и выставки.
Выставка оборудования ARVO имеет свои особенности: на ней представлено много устройств, томографов, приборов для электрофизиологических исследований и пр., которые необходимы для проведения экспериментов на животных. Поэтому все указанное оборудование имеет миниатюрные размеры и очень высокую стоимость.
Материал подготовила профессор Н.И. Курышева